Generering<em> De Novo</em> Antigen-spesifikke humane T-cellereseptorer etter retroviral transduksjon av Centric Hemichain
Summary
Heri vi beskrive en ny fremgangsmåte for å generere antigen-spesifikke T-celle-reseptorer (TCR) etter sammenkobling TCRα eller TCRβ av en eksisterende TCR, som har antigen-spesifisitet av interesse, med komplementære hemichain av den perifere T-cellereseptoren repertoar. De novo generert TCR beholde antigen-spesifisitet med varierende affinitet.
Abstract
T-celle-reseptorer (TCR) anvendes klinisk for å dirigere spesifisiteten til T-celler for å målrette mot svulster som et lovende modalitet av immunterapi. Derfor har klonings TCR som er spesifikke for forskjellige tumorassosierte antigener vært målet for mange studier. For å fremkalle en effektiv T-cellerespons, må den TCR gjenkjenne mål-antigenet med optimal affinitet. Imidlertid har kloning slik TCR vært en utfordring og mange tilgjengelige TCR har sub-optimal affinitet for beslektet antigen. I denne protokollen beskriver vi en metode for å klone de novo høy affinitet antigen-spesifikke TCR eksisterende TCR ved å utnytte hemichain fokus. Det er kjent at for enkelte TCR, trenger hver TCRα eller TCRβ hemichain ikke bidrar like mye til gjenkjenning av antigen, og den dominerende hemichain er referert til som den sentriske hemichain. Vi har vist at ved sammenkobling sentriske hemichain med counter-kjedene som avviker fra den opprinnelige disken-kjeden, er vi i stand til å opprettholde antigenet specificity, mens moduler dets interaksjon styrke for beslektet antigen. Således kan det terapeutiske potensialet for en gitt TCR forbedres ved å optimalisere paring mellom de sentriske og telleren hemichains.
Introduction
T-celle reseptorer (TCR) er heterodimere adaptive immun reseptorer uttrykt av T-lymfocytter, består av en TCRα og TCRβ kjeden. De er generert via somatisk rearrangement av V (D) J gensegmenter, som frembringer en svært mangfoldig repertoar stand til å gjenkjenne nesten ubegrenset konfigurasjoner av HLA / peptid-komplekser. Klinisk har T-celler konstruert for å uttrykke clonotypic TCR spesifikke for tumorassosierte antigener viste effekt i en rekke krefttyper 1. Men mange TCR klonede for dette formål mangle tilstrekkelig affinitet for antigenet av interesse, noe som begrenser deres terapeutiske anvendelse.
Her beskriver vi en metode for å overvinne denne begrensningen for eksisterende TCR ved å utnytte kjede-fokus. Det har blitt rapportert at en TCR hemichain kunne spille en mer dominerende rolle i erkjennelsen av målet antigen 2, her betegnet fokus. Crystal strukturelle analyser har vist at en sentriskhemichain av en TCR kunne stå for mesteparten av fotavtrykk på MHC / peptid kompleks 3,4. Ved hjelp av dette konseptet, har vi tidligere vist at SIG35α TCRα kan pare med et mangfoldig repertoar av TCRβ kjeder og opprett reaktivitet mot MART1 27-35 peptid presentert av HLA-A2 5. Lignende resultater ble oppnådd med den TAK1 TCR, hvor den sentriske TCRβ hemichain paret med ulike TCRα kjeder og opprettholdt reaktivitet for WT1 235-243 peptidet presentert av HLA-A24 6. Både MART1 og WT1 er tumorassosierte antigener. Kjede centricity ble også brukt til å studere antigen anerkjennelse av CD1d-bundne invariante natural killer (INKT) TCR, ved sammenkobling invariant Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα kjede av menneskelige INKT TCR med ulike Vβ11 TCRβ kjedene 7.
I alle tilfeller, vi var i stand til å generere en de novo repertoar av TCR av transducing den sentriske TCR hemichain til perifert blod T-celler, hvor det innføres hemichain forbundet med den endogene TCRα eller TCRβ counter-kjedene. I hovedsak fungerer den sentriske hemichain som et agn som kan brukes til å identifisere de passende counter-kjeder, som når paret sammen danner TCR som opprettholder den antigenet spesifisiteten av interesse, men som varierer i affinitet. Fra disse nye repertoar, var vi i stand til å isolere clonotypic TCR med forbedret samhandling styrke mot målet antigen i forhold til eksisterende TCR. Derfor tror vi denne metoden vil akselerere rørledningen for å identifisere optimale TCR for klinisk anvendelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den første forutsetning for vellykket bruk av denne fremgangsmåte er å oppnå tilstrekkelig effektivitet transduksjon av primære T-celler med den hemichain av interesse. Etter vår erfaring er kombinasjonen av å bruke PG13 som pakkecellelinje og pMX som retrovirale vektor resulterer i stabil og effektiv ekspresjon av det innførte gen i humane primære T-celler. PG13 emballasje celler kan være enkelt-celle klonet for å selektere for høy-titer pakkingscellene for å forbedre effektiviteten transduksjon. Videre er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., , ., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y., Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. 221, 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
