En murin model af gruppe B<em> Streptococcus</em> Vaginal Colonization

Summary

Formålet med denne protokol er at efterligne menneskelige gruppe B Streptococcus (GBS) vaginal kolonisering i en musemodel. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge værtsimmunresponser og bakterielle faktorer, der bidrager til GBS vaginal vedholdenhed, samt at teste terapeutiske strategier.

Abstract

Streptococcus agalactiae (gruppe B-Streptococcus, GBS), er en gram-positiv, asymptomatisk kolonisator af fordøjelsessystemet og vagina på 10 – 30% af voksne. I immunsvækkede individer, herunder nyfødte, gravide kvinder og ældre mennesker, kan GBS skifte til en invasiv patogen forårsager sepsis, gigt, lungebetændelse og meningitis. Fordi GBS er en førende bakterielt patogen af ​​nyfødte, er aktuel profylakse består af sene drægtighed screening for GBS vaginal kolonisering og efterfølgende peripartum antibiotisk behandling af GBS-positive mødre. Heavy GBS vaginal byrde er en risikofaktor for både neonatal sygdom og kolonisering. Desværre, lidt er kendt om værten og bakterielle faktorer, der fremmer eller tillader GBS vaginal kolonisering. Denne protokol beskriver en teknik til indførelse vedvarende GBS vaginal kolonisering anvendelse af en enkelt β-østradiol forbehandling og daglig prøvetagning til bestemmelse bakteriel load. It yderligere detaljer metoder til at administrere yderligere behandlinger eller reagenser af interesse og for at indsamle vaginal skyllevæske og reproduktive tarmkanalen væv. Denne musemodel vil fremme forståelsen af ​​GBS-vært interaktion inden for den vaginale miljø, hvilket vil føre til potentielle terapeutiske mål at kontrollere maternal vaginal kolonisering under graviditeten og for at forhindre transmission til sårbare nyfødte. Det vil også være af interesse at øge vores forståelse af generelle bakterielle-vært interaktioner i den kvindelige vagina.

Introduction

Streptococcus agalactiae, gruppe B-Streptococcus (GBS), er en indkapslet, gram-positiv bakterie, som ofte isoleret fra tarmen og urogenitale kanal af raske voksne. I 1970'erne, GBS opstået som den førende agent for smitsomme neonatal dødelighed, med over 7.000 tilfælde af neonatal sygdom årligt ^1. Tidlig debut GBS sygdom (EOD) forekommer i de første timer eller dage af livet, opstår som lungebetændelse eller åndedrætsbesvær, og ofte udvikler sig til sepsis, mens sent debuterende sygdom (LOD) ensues efter flere måneder og præsenterer med bakteriæmi, som ofte forskud til meningitis ^2. Som af 2002, Centers for Disease Control og Forebyggelse anbefaler universel screening for GBS vaginal kolonisering i slutningen drægtighed og intrapartum antibiotisk profylakse (IAP) til GBS-positive mødre ^1. På trods af den reduktion af tidlig debut sygdom til ca. 1.000 sager i USA årligt på grund af IAP,GBS er fortsat den hyppigste årsag til tidlig debut neonatal sepsis, og sent debuterende forekomst forbliver upåvirket ^1. Hvad enten i livmoderen, under fødslen, eller endda i sent forekommende tilfælde, neonatal eksponering for GBS kræver overlevelse, tværgående gennem en række værtsmiljøer og barrierer, immun unddragelse, og, i tilfælde af meningitis, passage af stærkt reguleret blod- hjernebarrieren ^2. Opstrøms for disse virulente interaktioner inden den nyfødte er den indledende kolonisering af moderens vagina. Maternal GBS vaginal kolonisering varierer fra 8-18% i de udviklede lande og udviklingslande, med en anslået gennemsnit på 12,7% ^3,4. GBS koloniseringen af vagina under graviditeten kan være konstant, intermitterende, eller forbigående mellem de enkelte kvinder ^5. Interessant, er en maternal alder> 36 år i forbindelse med vedvarende kolonisering ^6. Talrige biologiske og socio-økonomiske risikofaktorer for GBS vaginal koloniseringer blevet identificeret. Biologiske faktorer indbefatter gastrointestinale GBS kolonisering og fravær af Lactobacillus i tarmen. Imidlertid har ethnicity, fedme, hygiejne, og seksuel aktivitet også været forbundet med GBS vaginal vognen ^7.

Selvom berygtet for at forårsage neonatale infektioner, GBS forårsager også en række maternelle infektioner både peripartum og postpartum. GBS transport forøges i kvinder med vaginitis ⁸ og, i nogle tilfælde kan endda være sygdommen enhed ^9. Derudover kan GBS opstigning af den reproduktive tarmkanalen under graviditet resultere i intra-fostervand infektion eller chorioamnionitis ^10. Øvrigt i op til 3,5% af graviditeter, GBS formidler på urinblæren at forårsage en urinvejsinfektion eller asymptomatisk bakteriuri ^11. GBS bacteriuri under graviditet er forbundet med en øget risiko for intrapartum feber, chorioamnionitis, for tidlig fødsel, og premature hindebristning ^12. Tilsammen er tilstedeværelsen af ​​GBS i vagina knyttet til infektioner af multiple værtsvæv, og evnen til at eliminere GBS fra denne niche er bydende nødvendigt for både maternal og neonatal sundhed.

Indtil for nylig var størstedelen af arbejdet undersøger GBS interaktioner med cervicovaginal tarmkanalen begrænset til in vitro celle modeller ^13-15. Disse in vitro-forsøg har vist, bakterielle faktorer, der er vigtige for overholdelse, herunder overfladeproteiner sådan en pili og serin-rige gentagelser ^17,18, samt to-komponent reguleringsordninger ^15,19 og den globale transkriptionel respons vaginale epitel til GBS ^19. Men for at kunne belyse host-mikrobe interaktioner i vagina, et solidt dyremodel er nødvendig. Tidlig arbejde viste, at GBS kan genvindes fra vagina af podede mus ^20,21 og rotter <sup> 22 i både gravide og ikke-gravide betingelser. I 2005 blev kortvarig GBS vaginal kolonisering modelleret i mus for at undersøge effekten af en fag lytisk enzym til behandling af vaginal GBS over en 24 timers periode ^23. Flere år senere blev en langsigtet GBS vaginal kolonisering musemodel udviklet til at studere vært og bakterielle faktorer, der styrer GBS vedholdenhed. Denne model har identificeret adskillige GBS faktorer, der bidrager til kolonisering, herunder overflade vedhæng ^17,18 og GBS to-komponent systemer ^19,24. Denne model har bidraget til at identificere værten reaktionsmekanismer ^19,25 og blev brugt til at teste flere terapeutiske strategier, herunder immunmodulerende peptider ²⁶ og probiotika ^27. Denne protokol giver den nødvendige vejledning til at pode GBS i musen vagina og efterfølgende spore kolonisering og indsamle prøver til yderligere analyser.

Protocol

Alt dyr arbejde blev godkendt af Kontoret for Lab Animal Care på San Diego State University og udføres under anerkendte veterinære standarder. Hunmus, 8 år – 16 uger blev anvendt til udvikling af denne fremgangsmåde. 1. Fremstilling og intraperitoneal injektion af β-estradiol Mål ud β-østradiol (0,5 mg / mus) på afveje papir, mens iført egnede personlige værnemidler (PPE). ADVARSEL: β-estradiol kan optages gennem huden og slimhindeoverflader. Overfør β-estradi…

Representative Results

Under udviklingen af ​​denne model blev flere observationer gjort med hensyn faktorer, der påvirker varigheden af ​​GBS vaginal kolonisering. At bestemme, hvordan østrale stadium inokulering virkninger GBS bakteriel persistens blev mus iscenesat på dagen for inokulering via vaginal skyllevæske. Figur 1 illustrerer de fire faser af muse østrale cyklus, som bestemt ved våd-mount vaginal udskylningsvæske, en veletableret metode 29. Mus blev inddelt…

Discussion

For at fremme fremføringen af ​​forståelsen af ​​GBS interaktioner med både værten og andre mikrober i forbindelse med værten, er en dyremodel påkrævet. Dette arbejde beskriver de tekniske aspekter af indførelse af GBS vaginal kolonisering hos mus. Denne protokol opnår> 90% kolonisering af mus uden anvendelse af anæstetika til inokulering bakterier eller at indsamle prøver podning, immun-suppressants at muliggøre kolonisering, vaginal forvask, eller tilsætningsstoffer til at fortykke inokulum. De…

Materials

Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μL gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 mL syringes	BD	309604
1 mL syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Corning	21-031-CV