Een muizenmodel van groep B<em> Streptococcus</em> Vaginale Kolonisatie

Summary

Het doel van dit protocol is voor de menselijke groep B Streptococcus (GBS) vaginale kolonisatie na te bootsen in een muismodel. Deze werkwijze kan worden gebruikt om immuunreacties van de gastheer en bacteriële factoren die GBS vaginale persistentie te onderzoeken, alsmede therapeutische strategieën testen.

Abstract

Streptococcus agalactiae (groep B streptococcus, GBS) is een Gram-positieve, asymptomatische kolonisator van het menselijke maagdarmkanaal en vaginale kanaal van 10 – 30% van de volwassenen. In immuun-gecompromitteerde individuen, met inbegrip van pasgeborenen, zwangere vrouwen en ouderen, kan GBS overschakelen naar een invasieve ziekteverwekker die aan sepsis, artritis, longontsteking en hersenvliesontsteking. Omdat GBS is een toonaangevende bacterieel pathogeen van pasgeborenen, is de huidige profylaxe bestaat uit de late zwangerschap screening voor GBS vaginale kolonisatie en de daaropvolgende peripartum antibiotische behandeling van GBS-positieve moeders. Zware GBS vaginale last is een risicofactor voor zowel de neonatale ziekte en kolonisatie. Helaas is er weinig bekend over de gastheer en bacteriële factoren die bevorderen of toestaan ​​GBS vaginale kolonisatie. Dit protocol beschrijft een techniek voor zij hardnekkige GBS vaginale kolonisatie met één β-estradiol voorbehandeling en dagelijks bemonstering bacteriële loa bepalend. Het verdere details methoden om aanvullende therapieën of reagentia van belang te beheren en vaginale lavage vloeistof en voortplantingsorganen weefsels te verzamelen. Deze muis model zal het begrip van de GBS-gastheer interactie binnen de vaginale omgeving, die zal leiden tot een potentiële therapeutische doelen aan maternale vaginale kolonisatie controle tijdens de zwangerschap en de overdracht aan de kwetsbare pasgeboren voorkomen bevorderen. Het zal ook van belang zijn voor ons begrip van de algemene bacterie-gastheer interacties in de vrouwelijke vaginale-darmkanaal te verhogen.

Introduction

Streptococcus agalactiae, groep B Streptococcus (GBS), een ingekapselde, Gram-positieve bacterie die vaak wordt geïsoleerd uit de darm en urogenitale tractus van gezonde volwassenen. In de jaren 1970, GBS naar voren als de belangrijkste agent van besmettelijke neonatale sterfte, met meer dan 7.000 gevallen van neonatale ziekte jaarlijks ^1. Early-onset GBS-infectie (EOD) komt in de eerste uren of dagen van het leven, ontstaat als longontsteking of ademhalingsproblemen, en vaak ontwikkelt tot sepsis, terwijl de late vorm van de ziekte (LOD) ontstaat na enkele maanden en presenteert met bacteriëmie, die vaak voorschotten aan meningitis ^2. Met ingang van 2002, de Centers for Disease Control and Prevention beveelt universele screening voor GBS vaginale kolonisatie in de late zwangerschap en de bevalling antibioticaprofylaxe (IAP) naar GBS-positieve moeders ^1. Ondanks het terugdringen van de vorm van de ziekte tot ongeveer 1000 gevallen in de Verenigde Staten jaarlijks door IAP,GBS blijft de belangrijkste oorzaak van vroege-onset neonatale sepsis, en late-onset optreden blijft onaangetast ^1. Of het nu in de baarmoeder, tijdens de bevalling, of zelfs in late-onset gevallen, neonatale blootstelling aan GBS moet overleven, transversale via een aantal host-omgevingen en barrières, het immuunsysteem fraude, en, in het geval van meningitis, kruising van de sterk gereguleerde bloed- hersenbarrière ^2. Stroomopwaarts van deze virulente interacties binnen de pasgeborene is de eerste kolonisatie van de maternale vaginale kanaal. Maternale GBS vaginale kolonisatie tarieven variëren 8-18% in de ontwikkelde landen en ontwikkelingslanden, met een geschatte gemiddelde van 12,7% ^3,4. GBS kolonisatie van de vaginale-darmkanaal tijdens de zwangerschap kan constant, intermitterend of voorbijgaande aard onder individuele vrouwen ⁵ zijn. Interessant is dat een leeftijd van de moeder> 36 jaar in verband met aanhoudende kolonisatie ^6. Tal van biologische en sociaal-economische risicofactoren voor GBS vaginale kolonisatiegeïdentificeerd. Biologische factoren omvatten gastrointestinale GBS kolonisatie en afwezigheid van Lactobacillus in de darm. Echter, etniciteit, obesitas, hygiëne en seksuele activiteit ook in verband gebracht met GBS vaginale wagen ^7.

Hoewel bekend voor het veroorzaken neonatale infecties GBS veroorzaakt ook verschillende maternale infecties zowel peripartum en postpartum. GBS slede is verhoogd bij vrouwen presenteren met vaginitis ⁸ en in sommige gevallen zelfs het ziektebeeld ⁹ zijn. Bovendien kan GBS hemelvaart van de voortplantingsorganen tijdens de zwangerschap leiden tot een intra-amniotische infectie of chorioamnionitis ^10. Bovendien, tot 3,5% van de zwangerschappen, GBS verspreidt de urineblaas een urineweginfectie of asymptomatische bacteriurie ¹¹ veroorzaken. GBS bacteriurie tijdens de zwangerschap is geassocieerd met een verhoogd risico op de bevalling koorts, chorioamnionitis, vroeggeboorte en premature breken van de vliezen ^12. Samengevat, is de aanwezigheid van GBS in de vaginale kanaal houden met ontstekingen meerdere gastheerweefsels, en de mogelijkheid om GBS elimineren van deze niche is noodzakelijk voor zowel maternale en neonatale gezondheid.

Tot voor kort, de meeste werkzaamheden onderzoeken GBS interacties met de cervicovaginal tract werd alleen in vitro celmodellen ^13-15. Deze in vitro experimenten bacteriële factoren die belangrijk zijn voor hechting zijn, waaronder oppervlakte-eiwitten bleek zo'n pili en serine-rijke repeats ^17,18, evenals twee componenten regelsystemen ^15,19 en de globale transcriptionele respons van het vaginale epitheel GBS ^19. Echter, de gastheer-microbe interacties volledig helderen binnen het vaginale kanaal, een robuuste diermodel noodzakelijk. Vroeg werk aangetoond dat GBS uit de vaginale landstreek van geënte muizen ^20,21 en ratten kunnen worden hersteld <sup> 22 in zowel de zwangere en niet-zwangere omstandigheden. In 2005 werd op korte termijn GBS vaginale kolonisatie gemodelleerd bij muizen om de werkzaamheid van een faag lytisch enzym te onderzoeken tot vaginale GBS behandelen gedurende een periode van 24 uur ^23. Enkele jaren later, werd een lange-termijn GBS vaginale kolonisatie muismodel ontwikkeld om gastheer en bacteriële factoren die GBS doorzettingsvermogen te bestuderen. Dit model heeft talrijke GBS factoren die kolonisatie, waaronder oppervlak appendages ^17,18 en GBS tweecomponentensystemen ^19,24 geïdentificeerd. Dit model heeft bijgedragen tot de identificatie van gastheer respons mechanismen ^19,25 en werd gebruikt om verschillende therapeutische strategieën, met inbegrip van immunomodulerende peptiden ²⁶ en probiotica ²⁷ te testen. Dit protocol geeft de nodige begeleiding om GBS te enten in de muis vaginale-darmkanaal en vervolgens kolonisatie te volgen en het verzamelen van monsters voor verdere analyse.

Protocol

Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door het Bureau van Lab Animal Care in San Diego State University en uitgevoerd onder aanvaarde veterinaire normen. Vrouwelijke muizen, leeftijd 8-16 weken werden gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode. 1. Voorbereiding en intraperitoneale injectie van β-estradiol Meet β-estradiol (0,5 mg / muis) op weeg papier, terwijl het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). LET OP: β-oestradiol kan worden geabsorbeerd door de huid en sl…

Representative Results

Bij de ontwikkeling van dit model zijn verschillende opmerkingen over factoren die de duur van GBS vaginale kolonisatie beïnvloeden. Om te bepalen hoe estrous stadium bij enting gevolgen GBS bacteriële persistentie werden muizen gehouden op de dag van de inenting via vaginale lavage vloeistof. Figuur 1 illustreert de vier fasen van de muis loopsheid, zoals bepaald door middel van nat-mount vaginale lavage vloeistof, een bekende methode 29. Muizen werden verd…

Discussion

Om de voortgang van het begrijpen van GBS interactie met zowel de gastheer en andere microben in het kader van de gastheer te bevorderen, wordt een diermodel vereist. Dit werk beschrijft de technische aspecten van de oprichting van GBS vaginale kolonisatie in muizen. Dit protocol realiseert> 90% kolonisatie van muizen zonder het gebruik van anesthetica bacteriën enten of swabmonsters, immuun-onderdrukkende verzamelen om kolonisatie mogelijk, vaginale voorwassen of additieven voor het inoculum verdikken. Bovendien is…

Materials

Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μL gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 mL syringes	BD	309604
1 mL syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Corning	21-031-CV