Um modelo murino de Grupo B<em> Streptococcus</em> Colonização Vaginal

Summary

O objectivo deste protocolo é imitar grupo humano B Streptococcus (GBS) colonização vaginal num modelo murino. Este método pode ser utilizado para investigar as respostas imunes do hospedeiro e factores que contribuem para GBS bacterianas persistência vaginal, bem como para testar estratégias terapêuticas.

Abstract

Streptococcus agalactiae (Streptococcus do grupo B, o GBS), é uma bactéria Gram-positiva, colonizador assintomática do tracto gastrointestinal humano e tracto vaginal de 10 – 30% dos adultos. Em indivíduos imunocomprometidos, incluindo recém-nascidos, mulheres grávidas e idosos, GBS pode mudar para um patógeno invasiva causando septicemia, artrite, pneumonia e meningite. Porque GBS é um patógeno bacteriano líder de recém-nascidos, a profilaxia atual é composto por triagem de gestação tarde para GBS colonização vaginal e subsequente tratamento com antibióticos periparto das mães GBS-positivos. fardo pesado vaginal GBS é um fator de risco para a doença neonatal e colonização. Infelizmente, pouco se sabe sobre o anfitrião e os fatores bacterianos que promovem ou permitem GBS colonização vaginal. Este protocolo descreve uma técnica para o estabelecimento de colonização vaginal GBS persistente utilizando um β-estradiol único pré-tratamento e de colheitas diárias para determinar loa bacterianad. Acrescenta detalhes métodos para administrar terapias ou reagentes de interesse adicionais e recolher fluido de lavagem vaginal e nos tecidos do trato reprodutivo. Este modelo do rato irá aumentar a compreensão da interação GBS-host dentro do ambiente vaginal, o que levará a potenciais alvos terapêuticos para controlar a colonização vaginal materna durante a gravidez e para prevenir a transmissão ao recém-nascido vulnerável. Também será de interesse para aumentar a nossa compreensão de interações bacterianas-hospedeiro geral no trato vaginal feminino.

Introduction

Streptococcus agalactiae, Streptococcus do grupo B (GBS), é uma bactéria encapsulada, Gram-positiva, que é frequentemente isolada a partir do intestino e do trato genito-urinário de adultos saudáveis. Na década de 1970, GBS emergiu como o principal agente da mortalidade neonatal infecciosa, com mais de 7.000 casos de doença neonatal por ano ^1. De início precoce da doença GBS (EOD) ocorre nas primeiras horas ou dias de vida, surge como pneumonia ou insuficiência respiratória, e muitas vezes se desenvolve em sepse, enquanto a doença de início tardio (LOD) segue-se depois de vários meses e se apresenta com bacteremia, que frequentemente avança para a meningite ^2. A partir de 2002, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças recomenda a triagem universal para GBS colonização vaginal na gestação tardia e profilaxia antibiótica intraparto (IAP) para mães GBS-positivos ^1. Apesar da redução da doença de início precoce de aproximadamente 1.000 casos nos Estados Unidos, anualmente devido a IAP,GBS continua a ser a principal causa de sepse neonatal de início precoce e ocorrência de início tardio permanece inalterado ^1. Se no útero, durante o parto, ou até mesmo em casos de início tardio, a exposição neonatal a GBS requer sobrevivência, transversal através de um número de ambientes de host e barreiras, a evasão imune, e, no caso de meningite, travessia do Sangue altamente regulado barreira do cérebro ^2. A montante destas interacções virulentas no recém-nascido é a colonização inicial do tracto vaginal materna. Materna GBS taxas de colonização vaginal variam de 8-18% em países desenvolvidos e em desenvolvimento, com uma taxa média estimada de 12,7% ^3,4. GBS colonização do tracto vaginal durante a gravidez pode ser constante, intermitente, ou de natureza transitória entre as mulheres individuais ^5. Curiosamente, a idade materna> 36 anos está associada à colonização persistente ^6. Inúmeros fatores de risco biológicos e sócio-econômicas para GBS colonização vaginaltem sido identificado. Os factores biológicos incluem a colonização gastrointestinal GBS e ausência de Lactobacillus no intestino. No entanto, a etnia, a obesidade, higiene e atividade sexual também têm sido associados com GBS vaginal ^7.

Embora conhecido por causar infecções neonatais, GBS também causa uma variedade de infecções maternas ambos periparto e pós-parto. GBS é aumentada em mulheres que apresentam vaginite ⁸ e, em alguns casos, pode mesmo ser a entidade de doença ^9. Além disso, o GBS de ascensão do trato reprodutivo durante a gravidez podem resultar em infecção intra-amniótica ou corioamniotite ^10. Além disso, em até 3,5% de gravidezes, GBS difunde para a bexiga urinária para causar uma infecção do tracto urinário ou bacteriúria assintomática ^11. bacteriúria GBS durante a gravidez está associado a um aumento do risco de febre intraparto, corioamnionite, parto prematuro, e premature ruptura de membranas ^12. Tomados em conjunto, a presença de GBS dentro do trato vaginal está associado a infecções de vários tecidos do hospedeiro, e a capacidade de eliminar GBS deste nicho é imperativo para a saúde materna e neonatal.

Até recentemente, a maioria do trabalho examinar interacções de GBS com o tracto genital do foi limitada a modelos celulares in vitro ^13-15. Estas experiências in vitro revelaram factores bacterianos que são importantes para a adesão, incluindo as proteínas de superfície, tais pili e uma rica em serina repetições ^17,18, bem como sistemas reguladores de dois componentes ^15,19 e a resposta de transcrição global do epitélio vaginal para GBS ^19. No entanto, para elucidar totalmente as interacções hospedeiro-micróbio no tracto vaginal, um modelo animal robusta é necessário. Os primeiros trabalhos demonstraram que o GBS podem ser recuperados a partir do tracto vaginal de ratinhos inoculados ratos e ^20,21 <sup> 22 em ambas as condições grávidas e não grávidas. Em 2005, a curto prazo GBS colonização vaginal foi modelada em murganhos para examinar a eficácia de uma enzima lítica de fagos para tratar GBS vaginal durante um período de 24 h ^23. Vários anos mais tarde, um GBS mouse modelo de colonização vaginal longo prazo foi desenvolvido para estudar hospedeiras e bacterianas fatores que regem GBS persistência. Este modelo identificou vários fatores que contribuem para GBS colonização, incluindo apêndices superficiais ^17,18 e GBS sistemas de dois componentes ^19,24. Este modelo contribui para a identificação de mecanismos de resposta do hospedeiro ^19,25 e foi usado para testar várias estratégias terapêuticas, incluindo péptidos imunomoduladores ²⁶ e ²⁷ probióticos. Este protocolo dá a orientação necessária para inocular GBS para o trato vaginal mouse e para controlar posteriormente colonização e coletar amostras para análises posteriores.

Protocol

Todo o trabalho animal foi aprovada pelo Escritório de Laboratório Animal Care na Universidade Estadual de San Diego, e executada sob normas veterinárias aceites. ratinhos fêmeas, com idade de 8 – 16 semanas, foram utilizados para o desenvolvimento deste método. 1. Preparação e injecção intraperitoneal de β-estradiol Meça β-estradiol (0,5 mg / rato) em pesar papel enquanto usava equipamento de proteção individual (EPI). CUIDADO: β-estradiol pode ser absorvida através d…

Representative Results

Durante o desenvolvimento deste modelo, várias observações foram feitas em relação aos fatores que afetam a duração do GBS colonização vaginal. Para determinar o estágio como estral em impactos inoculação GBS persistência bacteriana, os ratos foram encenadas no dia da inoculação através de lavado vaginal. A Figura 1 ilustra as quatro fases do ciclo estral de rato, como determinado pela húmida de montagem em fluido de lavagem vaginal, um método bem estab…

Discussion

Para promover o avanço da compreensão das interacções de GBS com a ambos o hospedeiro e outros micróbios no contexto do hospedeiro, é necessário um modelo animal. Este trabalho descreve os aspectos técnicos da criação de GBS colonização vaginal em ratos. Este protocolo realiza> 90% de colonização de murganhos sem a utilização de anestésicos para inocular bactérias ou para recolher amostras de esfregaço, imuno-supressores para permitir a colonização, pré-lavagem vaginal, ou aditivos para engrossa…

Materials

Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μL gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 mL syringes	BD	309604
1 mL syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Corning	21-031-CV