Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em> In Vitro</em> Cancer Models
Summary
Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in – vitro – Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR – basierte Methode Kandidatengene zu validieren.
Abstract
Arzneimittelresistenz bleibt ein Hauptproblem bei der Behandlung von Krebs sowohl hämatologischen Malignitäten und soliden Tumoren. Intrinsic oder erworbene Resistenz kann durch eine Reihe von Mechanismen verursacht werden, einschließlich der erhöhten medikamentenbeseitigende, verringerte Arzneimittelaufnahme, Drogen Inaktivierung und Veränderungen von Arzneimitteltargets. Die jüngsten Daten zeigten, dass anders als durch bekannte genetische (Mutation, Verstärkung) und epigenetische (DNA-Hypermethylierung, Histon-post-translationale Modifikation) Modifikationen, Drogenresistenzmechanismen könnten auch durch Spleißen Verirrungen geregelt werden. Dies ist ein schnell wachsender Bereich der Untersuchung, die Zukunft Aufmerksamkeit, um verdient effektiver Therapieansätze zu planen. Das Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird, bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile von mehreren in – vitro – Modellen durch RNA-seq und etablierened ein qRT-PCR-basierte Methode Kandidatengene zu validieren. Insbesondere untersuchten wir die Differential Spleißen von DDX5 und PKM-Transkripte. Die anomale Spleißen von der Rechenwerkzeug erkannt MATS wurde in leukämischen Zellen validiert, die zeigen, dass unterschiedliche DDX5 Splice-Varianten sind in den elterlichen gegen resistente Zellen exprimiert wird. In diesen Zellen beobachteten wir auch eine höhere PKM2 / PKM1 Verhältnis, das nicht in der Panc-1 Gemcitabin festen Gegenstück im Vergleich zu parentalen Panc-1-Zellen nachgewiesen wurde, einen anderen Mechanismus der Arzneimittelresistenz vorgeschlagen von Gemcitabin Exposition induziert.
Introduction
Trotz erheblicher Fortschritte in der Krebsbehandlung, Resistenz von bösartigen Zellen gegenüber Chemotherapie, entweder intrinsisch oder bei längerer Arzneimittelexposition erfasst, ist der Hauptgrund für Therapieversagen in einem weiten Bereich von Leukämien und soliden Tumoren 1.
Um die zugrunde liegenden Mechanismen Medikamentenresistenz in vitro – Zelllinie Modelle zu beschreiben sind , durch schrittweise Auswahl von Krebszellen resistent gegen chemotherapeutische Wirkstoffe entwickelt. Dieses Verfahren ahmt die Regime in den klinischen Einstellungen verwendet und erlaubt daher die gründliche Ermittlung relevanter Resistenzmechanismen. Resistente Zellen , die die Behandlung überleben , werden dann von der elterlichen empfindlichen Zellen zeichnen sich durch Verwendung von Zelllebensfähigkeit / Cytotoxizitätsassays 2. In vitro drug resistance Profile von Primärzellen wurden signifikant im Zusammenhang mit klinischen Ansprechens auf eine Chemotherapie 3 erwiesen.
Hochdurchsatz-cytotoxicity Tests stellen eine bequeme Methode Arzneimittelempfindlichkeit in vitro zu bestimmen. Hierin wird die Lebensfähigkeit der Zellen bewertet , indem beispielsweise die 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide – MTT – Assay 4, die auf metabolischen Umwandlung bestimmter Substrate basiert (dh Tetrazoliumsalze) in farbige Produkte, wodurch die mitochondriale Aktivität der Zellen widerspiegelt. Alternativ kann die zelluläre Proteingehalt quantifiziert werden unter Verwendung des Sulforhodamin B (SRB) Test 5. Hier ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen proportional zu der optischen Dichte (OD) bei einer geeigneten Wellenlänge in einem Spektrophotometer gemessen, ohne die Notwendigkeit umfangreiche und zeitraubende Zellzählung Verfahren. Die Wachstumshemmung durch ein bestimmtes chemotherapeutisches Arzneimittel induzierte kann basierend auf der OD der Vertiefungen, in denen Zellen mit einem Testmittel und im Vergleich mit der OD der unbehandelten Kontrollzellen behandelt wurden, berechnet werden. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve ist OBTAined durch Arzneimittelkonzentrationen oder Prozent der lebenden Zellen relativ zu Kontrollzellen aufgetragen ist. Schließlich können Arzneimittelempfindlichkeit als die Konzentration angegeben, die in 50% der Hemmung des Zellwachstums führt , im Vergleich zu unbehandelten Zellen (IC 50).
Die Mechanismen, Arzneimittelresistenz zugrunde lagen, sind viele verschiedene Auffälligkeiten, wie Veränderungen der Genexpression von Determinanten der Arzneimittelaktivität und den Zellstoffwechsel beeinflussen. Diese molekularen Läsionen, einschließlich Mutationen, Abbildungsfehler bei einer Transkription und post-transkriptioneller Ebene sowie gestört epigenetischen Regulation oft Gene beeinflussen beteiligt entweder in den Arzneimittelmetabolismus oder Apoptose 6.
Alternative pre-mRNA Splicing und seine komplizierten Regelung haben kürzlich beträchtliche Aufmerksamkeit als eine neue Entität empfangen , die Medikamentenresistenz von Krebszellen 7 diktieren kann. Bis zu 95% der menschlichen Gene werden alternativ in normalen Zellen mittels dieser gespleißtenstark regulierten Prozess, der viele verschiedene Protein-Isoformen aus dem gleichen Gen produziert. Alternatives Spleißen wird häufig in Krebs dereguliert und mehrere Tumoren werden durch veränderte Spleißen von einer wachsenden Anzahl von Genen in den Arzneimittelmetabolismus (dh Desoxycytidinkinase, folylpolyglutamate synthetase oder Multidrug – Resistenz – Proteine) 6,8 beteiligt gekennzeichnet. Eine umfassende Analyse der Splicing Profile von arzneimittelresistenten Zellen ist schmerzlich fehlt. Daher ist es zwingend notwendig, Hochdurchsatzverfahren für alternative Splicing-Analyse zu entwickeln. Dies könnte helfen, effektiver Therapieansätze zu entwickeln.
Während des letzten Jahrzehnts, die rasante Entwicklung der nächsten Generation Sequenzierung (NGS) Technologien hat die biomedizinische Forschung , angereichert mit neuen Einsichten in die molekularen Mechanismen Regulation der Genomexpression regeln und ihre Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen 9. RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist eine leistungsfähige Unteranwendungvon NGS im Bereich der Transkriptomik. Es ermöglicht eine genomweite Profilierung (qualitativ und quantitativ) der Expressionsmuster von Tausenden von Genen gleichzeitig und ist gut geeignet für die Charakterisierung von neuen Codierung mRNAs sowie lange nicht-codierende RNA, miRNA, siRNA und andere kleine RNA Klassen (zB snRNA und piRNA) 10,11.
RNA-Seq hat viele Vorteile gegenüber den bisherigen Technologien zur Charakterisierung Transkriptom (zB Sanger Sequenzierung und Expression Microarrays). Es ist nicht auf bestehende Genomannotation basiert, hat es einen single-nucleotide Höhe der Auflösung und es hat einen breiteren Dynamikbereich für Expressionsniveau Schätzung. Kurz gesagt, besteht die grundlegende experimentelle Workflow von RNA-seq Experimente von polyadenylierte Transkript (mRNA) Selektion und Fragmentierung, gefolgt von der Umwandlung in cDNA, Bibliothekskonstruktion und schließlich massiv parallele tiefe Sequenzierung 12,13. Aufgrund der schnellen Tropfen sequencing Kosten in den letzten Jahren, RNA-seq ersetzt nach und nach anderen Technologien und erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um die Bibliothek Vorbereitung Protokolle zu verbessern. Zum Beispiel ist es nun möglich, den Strang mit Informationen von mRNA-Transkripten zu erhalten, indem der zweite Strang cDNA mit Desoxyuridintriphosphat Markierung (dUTP) und vor der PCR-Amplifikation, Verdau des markierten Strangs mit Uracil-DNA-glycosilase (UDG). Dieser Prozess erhöht die Genauigkeit der Gen – Annotation und Abschätzung der Expressionsniveaus 14,15.
Die Analyse und Interpretation von RNA-seq Daten erfordern komplexe und leistungsfähige Berechnungssoftwarepakete und Verarbeitung in bioinformatischen Pipelines 16,17. Zuerst liest die rohe durch Beseitigung der technischen und biologischen Artefakte Qualitätskontrolle zu unterziehen und zu verwerfen (Trimmen), um die Sequenzen, die keine strengen Qualitätsanforderungen erreichen. Anschließend liest die für jede Probe zu einem Referenzgenom abgebildet werden und indiziertin Gen-Ebene, Exon-Ebene oder Transkript-Ebene, um die Fülle der einzelnen Kategorien zu bestimmen. Je nach Anwendung werden verfeinerten Daten dann durch statistische Modelle zur Identifizierung von Allel-spezifische Expression, alternative Spleißen, Genfusionen und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) 12 berechnet. Schließlich auf ausgewählte Ebene Differentialanalyse (dh Genexpression oder alternatives Spleißen) können verwendet werden , um Proben unter verschiedenen Bedingungen erhaltenen zu vergleichen.
Differential Splicing-Analyse beschreibt die Unterschiede in Spleißstelle Verwendung zwischen zwei Proben. Eine zunehmende Anzahl von Software zu diesem Zweck gewidmet Pakete stehen zur Verfügung auf der Grundlage verschiedener statistischer Modelle, Performances und Benutzeroberfläche 18. Unter diesen MATS (Multivariate Analyse von Transcript Splicing) entpuppt sich als frei verfügbar und präzise Berechnungstool auf der Basis eines Bayes-statistischer Rahmen und zu erkennen verschie entworfenrenz Splicingereignisse aus einzelnen oder paarweise Ende RNA-seq Daten. Ausgehend von den ausgerichteten (.bam) Dateien können MATS erkennen alle gängigen Arten von alternativen Splicingereignisse (Exon – Skipping, alternative 3'Spleißstelle, alternative 5'Spleißstelle, sich gegenseitig ausschließende Exons und Introns Bindung – auch siehe Abbildung 1).
Zuerst liest die Software identifiziert, die eine bestimmte Spleiß-Ereignis, zum Beispiel Exon-Skipping unterstützen und klassifiziert sie in zwei Typen. "Inklusion liest" (für die kanonische Spleiß-Ereignis) Karte innerhalb des untersuchten Exons und die Übergänge zwischen diesen spezifischen Exon und den beiden vor- und nachgelagerten flankierenden Exons erstrecken. "Skipping liest" (für die alternative Spleiß-Ereignis) zwischen den beiden flankierenden Exons der Kreuzung erstrecken. Anschließend kehrt MATS die normierte Aufnahme Ebene sowohl für die kanonische und alternative Veranstaltungen und vergleicht Werte zwischen den Proben oder Bedingungen. Letztlich berechnet es P-Wert einnd falsche Entdeckung Rate (FDR) unter der Annahme , dass die Differenz in der Variante Verhältnis eines Gens zwischen zwei Zuständen überschreitet einen bestimmten benutzerdefinierten Schwelle für jeden Spleißvorgang 19,34.
Nach Differential Splicing – Analyse in Verbindung mit RNA-seq eine umfangreiche experimentelle Validierung ist gerechtfertigt , um wahr-positive Gen – Kandidaten 18 zu identifizieren. Quantitative Reverse Transkription-Polymerase – Kettenreaktion (qRT-PCR) ist die am häufigsten verwendete und optimale Verfahren bei der Validierung von Kandidaten von RNA-Seq – Analyse 20 erhalten. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine robuste Methode zur Verfügung zu stellen drug resistance bezogenen Spleißen Profile in soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten zu untersuchen. Unser Ansatz nutzt RNA-seq-basierte Transkriptom Profilierung ausgewählter Zelllinie Modelle von arzneimittelresistenten Krebserkrankungen in Kombination mit einer etablierten qRT-PCR-Verfahren zur Validierung von Kandidatengenen in Arzneimittelresistenz beteiligt.
<p class = "jove_content"> Die menschliche Leukämiezelllinie Modelle in dieser Studie verwendeten pädiatrischen enthalten T-Zell-akute lymphatische Leukämie (T-ALL) Zelllinie CCRF-CEM (CEM-WT), seinen zwei Glucocorticoid (GC) -resistenten Subklone CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) und CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 und die Methotrexat (MTX) -resistenten subline CEM / R30dm 23. Obwohl die derzeitigen Therapien auf Basis von GCs und MTX in etwa 90% der Fälle klinischer Nutzen schaffen, stellt die Entstehung von GC-Resistenz noch ein ungelöstes Problem mit einem unklaren molekularen Mechanismus. GC-resistente Subklone, CEM-WT-Zellen wurden in 1 uM Dexamethason (Dex) für 2 bis 3 Wochen isolieren. MTX-resistente subline CEM / R30dm wurde durch wiederholte kurzfristige (24 h) Exposition von CEM-WT-Zellen auf 30 & mgr; M MTX als Mimik der klinischen Protokolle entwickelt. Interessanterweise ist auch diese Zelllinie angezeigt Kreuzresistenz gegen Dex (unveröffentlichte Ergebnisse), für die der Mechanismus nicht vollständig verstanden wird.Der feste Tumoder das Modell in der vorliegenden Studie untersucht ist duktalen Adenokarzinom des Pankreas, berüchtigt für seine außergewöhnlichen refractoriness auf die Chemotherapie. Zu diesem Zweck wählten wir Panc-1 – Zelllinie und die Gemcitabin-resistenten Subklon Panc-1R durch kontinuierliche Inkubation mit 1 & mgr; M des Medikaments 24. Hier beschreiben wir einen Ansatz neuartige Mechanismen zu entdecken , in-vitro – Arzneimittelresistenz zugrunde liegenden durch die Kombination von drei Protokolle: kolorimetrisch Cytotoxizitätsassays Arzneimittelempfindlichkeit in leukämischen Zellen und Krebszellen von soliden Tumoren, RNA-seq-basierte Pipeline zu identifizieren , neue Splice – Varianten zu beurteilen , in Bezug auf Arzneimittelempfindlichkeit / Widerstand und RT-PCR und qRT-PCR-Analyse potenzielle Kandidaten zu validieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, der gut etablierten Zytotoxizität Techniken Screening kombiniert und leistungsstarke NGS-basierte Transkriptom-Analysen in Bezug auf Arzneimittelresistenz Differential Splicingereignisse zu identifizieren. Spektrophotometrische Assays sind bequem und robust Hochdurchsatzverfahren Arzneimittelempfindlichkeit in in – vitro – Krebsmodellen und stellen die erste Wahl für viele Labors durchführen Zytotoxizität Screenings zu bewerten. Fehlerbehebung sowie möglich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
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