Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em> In Vitro</em> modelli di cancro
Summary
Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.
Abstract
La resistenza ai farmaci rimane un problema importante nel trattamento del cancro sia per neoplasie ematologiche e tumori solidi. resistenza intrinseca o acquisita può essere causato da una serie di meccanismi, tra cui una maggiore eliminazione del farmaco, diminuito assorbimento di droga, l'inattivazione di droga e alterazioni dei bersagli farmacologici. Dati recenti hanno mostrato che oltre dal noto genetica (mutazione, amplificazione) ed epigenetici (metilazione del DNA, istoni modificazioni post-traduzionali) modifiche, i meccanismi di resistenza ai farmaci potrebbe anche essere regolata da aberrazioni splicing. Si tratta di un settore in rapida crescita di indagine che richiede un'ulteriore riflessione al fine di pianificare approcci terapeutici più efficaci. Il protocollo descritto in questo documento ha lo scopo di investigare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica di diversi modelli in vitro attraverso RNA-Seq e stabilireEd un qRT-PCR metodo basato per convalidare geni candidati. In particolare, abbiamo valutato la splicing differenziale di DDX5 e PKM trascrizioni. Il aberrant splicing rilevato dallo strumento computazionale MATS stato convalidato in cellule leucemiche, mostrando che le diverse varianti di splicing DDX5 sono espresse nelle cellule resistenti vs parentale. In queste cellule, abbiamo anche osservato un rapporto più elevato PKM2 / PKM1, che non è stato rilevato nel Panc-1 controparte gemcitabina-resistenti rispetto ai genitori Panc-1 le cellule, suggerendo un diverso meccanismo di farmaco-resistenza indotta dall'esposizione gemcitabina.
Introduction
Nonostante i notevoli progressi nel trattamento del cancro, la resistenza delle cellule maligne alla chemioterapia, sia intrinseco o acquisito in seguito ad esposizione al farmaco prolungata, è il motivo principale per il fallimento del trattamento in una vasta gamma di leucemie e tumori solidi 1.
Al fine di delineare i meccanismi alla base della resistenza ai farmaci, in modelli in vitro di linee cellulari sono stati sviluppati da selezione graduale di cellule tumorali resistenti agli agenti chemioterapici. Questa procedura imita i regimi utilizzati nelle impostazioni cliniche e permette quindi a un'indagine approfondita dei meccanismi di resistenza rilevanti. Cellule resistenti che sopravvivono al trattamento sono poi distinti da cellule sensibili parentali utilizzando saggi di vitalità cellulare / citotossicità 2. In profili di resistenza ai farmaci in vitro di cellule primarie hanno dimostrato di essere significativamente correlata alla risposta clinica alla chemioterapia 3.
High-throughput cytotosaggi tossicità costituiscono un metodo conveniente per determinare la sensibilità ai farmaci in vitro. Qui, la vitalità delle cellule è valutata per esempio 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromide – MTT assay 4, che si basa sulla conversione metabolica di alcuni substrati (cioè, sali di tetrazolio) in prodotti colorati, riflettendo così l'attività mitocondriale di cellule. In alternativa, il contenuto di proteina cellulare può essere quantificata usando il saggio 5 sulforodamina B (SRB). Qui, il numero di cellule vitali è proporzionale alla densità ottica (OD) misurata ad una lunghezza d'onda appropriata in uno spettrofotometro, senza bisogno di ampio e che richiede tempo procedure di conteggio delle cellule. L'inibizione della crescita indotto da un certo farmaco chemioterapico può essere calcolato sulla base del diametro esterno dei pozzetti in cui le cellule sono state trattate con un agente di prova e comparati con il diametro esterno di cellule di controllo non trattate. Una curva dose-risposta è obtained tracciando concentrazioni di farmaco rispetto a percentuali di cellule vitali relativi alle cellule di controllo. Infine, la sensibilità ai farmaci può essere riportato come la concentrazione che provoca il 50% di inibizione della crescita cellulare rispetto alle cellule non trattate (IC 50).
I meccanismi alla base della resistenza ai farmaci includono molte anomalie differenti, come alterazioni influenzano l'espressione genica dei determinanti di attività di droga e il metabolismo cellulare. Queste lesioni molecolari, tra cui le mutazioni, aberrazioni ad un trascrizionale e livello post-trascrizionale, nonché regolazione epigenetica disturbato spesso colpiscono geni coinvolti sia nel metabolismo dei farmaci o apoptosi 6.
Alternative splicing pre-mRNA e la sua regolazione intricata hanno recentemente ricevuto una notevole attenzione come un romanzo entità che possono dettare la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali 7. Fino al 95% dei geni umani sono splicing alternativo in cellule normali mediante questostrettamente regolamentato processo che produce molte isoforme di proteine differenti dallo stesso gene. Splicing alternativo è spesso liberalizzato nel cancro e diversi tumori sono caratterizzati da splicing alterato di un numero crescente di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci (ad esempio, deossicitidina chinasi, sintetasi foli, o proteine multifarmaco resistenza) 6,8. Tuttavia, un'analisi completa dei profili di giunzione delle cellule resistenti ai farmaci è dolorosamente carente. Pertanto, è imperativo sviluppare metodi high throughput per analisi alternative splicing. Questo potrebbe aiutare a sviluppare approcci terapeutici più efficaci.
Durante l'ultimo decennio, il rapido sviluppo delle tecnologie di prossima generazione di sequenziamento (NGS) ha arricchito la ricerca biomedica con nuove informazioni sui meccanismi molecolari che regolano regolazione dell'espressione del genoma e il loro ruolo in vari processi biologici 9. RNA-sequenziamento (RNA-Seq) è un potente sub-applicazionedi NGS nel campo della trascrittomica. Esso consente una profilazione genome-wide (qualitativamente e quantitativamente) dei modelli di espressione di migliaia di geni contemporaneamente e ben si adatta per la caratterizzazione di nuovi mRNA codificanti così come lungo l'RNA non codificante, miRNA, siRNA, e altri piccoli RNA classi (ad esempio, snRNA e Pirna) 10,11.
RNA-Seq ha molti vantaggi rispetto alle tecnologie precedenti per la caratterizzazione del trascrittoma (ad esempio, Sanger sequenziamento e microarray di espressione). Essa non si basa su l'annotazione del genoma esistente, ha un livello di singolo nucleotide di risoluzione e ha una gamma dinamica più ampia per la stima livello di espressione. In breve, il flusso di lavoro sperimentale di base di esperimenti di RNA-Seq è costituito da poliadenilato trascrizione (mRNA) la selezione e la frammentazione, seguita da conversione in cDNA, di costruzione di biblioteche e sequenziamento profondo, infine, massicciamente paralleli 12,13. A causa della rapida diminuzione della sequencincosti g Nel corso degli ultimi anni, l'RNA-Seq sta gradualmente sostituendo le altre tecnologie e sforzi significativi sono stati fatti per migliorare i protocolli di preparazione biblioteca. Per esempio, è ora possibile per conservare le informazioni filo di trascritti di mRNA segnando il secondo filone di cDNA con deossiuridina trifosfato (dUTP) e, prima di amplificazione PCR, digerire il filo segnato con uracile-DNA-glycosilase (UDG). Questo processo aumenta la precisione di annotazione genica e stima dei livelli di espressione 14,15.
L'analisi e l'interpretazione dei dati di RNA-Seq richiedono pacchetti software di calcolo complesse e potenti e la trasformazione delle condutture bioinformatici 16,17. In primo luogo, la cruda legge subiscono il controllo di qualità, eliminando artefatti tecnici e biologici e scartando (trimming) le sequenze che non raggiungono i requisiti di qualità rigorosi. Successivamente la legge per ogni campione sono mappati ad un genoma di riferimento e indicizzatoin gene-livello, esone livello o livello di trascrizione, per determinare l'abbondanza di ciascuna categoria. A seconda dell'applicazione, i dati ricercati sono poi calcolate attraverso modelli statistici per l'identificazione di espressione allele-specifica, splicing alternativo, fusioni geniche e polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) 12. Infine, l'analisi differenziale sul livello selezionato (cioè, l'espressione genica o splicing alternativo) può essere utilizzata per confrontare campioni ottenuti in condizioni diverse.
Analisi splicing differenziale descrive le differenze di utilizzo del sito di splicing tra i due campioni. Un numero crescente di pacchetti software dedicati a questo scopo sono disponibili sulla base di diversi modelli statistici, le prestazioni e l'interfaccia utente 18. Tra questi, Mats (Analisi multivariata di Trascrizione Splicing) emerge come uno strumento di calcolo liberamente disponibile e preciso sulla base di un quadro statistico Bayesiano e progettati per rilevare diffeeventi di splicing renziale da entrambi i dati RNA-Seq singoli o accoppiati end. Partendo dai file allineate (.bam), STUOIE in grado di rilevare tutti i principali tipi di eventi alternativi di splicing (exon skipping, alternativa 'sito di splicing alternativo, 5' 3 sito di splicing, esoni si escludono a vicenda e ritenzione di introni – anche vedi Figura 1).
Innanzitutto, identifica software legge che supportano un certo evento giunzione, per esempio esone skipping e le classifica in due tipi. "Inclusione legge" (per l'evento giunzione canonica) mappare all'interno del esone indagato e abbracciare le giunzioni tra quella specifica esone e le due esoni fiancheggianti a monte ea valle. "Skipping legge" (per l'evento di splicing alternativo) abbracciano la giunzione tra i due esoni fiancheggianti. Successivamente, MATS restituisce il livello di inclusione normalizzato per entrambi gli eventi canonici e alternativi e confronta i valori tra i campioni o condizioni. Infine, calcola P-value unnd false discovery rate (FDR) supponendo che la differenza nel rapporto variante di un gene tra due condizioni supera una soglia definita dall'utente per ciascun evento splicing 19,34.
A seguito di analisi di splicing differenziale in combinazione con RNA-Seq, una vasta validazione sperimentale è giustificato al fine di identificare i candidati veri positivi gene 18. Quantitative inversione trascritto-polymerase chain reaction (qRT-PCR) è il metodo più comunemente utilizzato e ottimale in validazione dei candidati ottenuti dalle analisi di RNA-Seq 20. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire una solida metodologia per indagare Profili di droga splicing di resistenza legate nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. Il nostro approccio utilizza RNA-Seq-based trascrittoma profili dei modelli di linee cellulari selezionate di tumori resistenti ai farmaci in combinazione con un metodo di qRT-PCR stabilito per la validazione dei geni candidati coinvolti nella resistenza ai farmaci.
<p class = "jove_content"> I modelli della linea di cellule di leucemia umana utilizzati in questo studio hanno incluso pediatrico cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) linea cellulare CSFR-CEM (CEM-WT), i suoi due glucocorticoidi (GC) resistente subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) e CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 e il metotrexato (MTX) Subline resistente CEM / R30dm 23. Anche se le attuali terapie a base di GC e MTX stabilire beneficio clinico in circa il 90% dei casi, la comparsa di GC-resistenza rappresenta ancora un problema irrisolto con un meccanismo molecolare chiaro. Per isolare sub-cloni GC-resistente, le cellule CEM-WT sono state coltivate in 1 micron dexametasone (Des) per 2 o 3 settimane. Subline MTX-resistente CEM / R30dm è stato sviluppato attraverso ripetuta a breve termine (24 ore) esposizione delle cellule CEM-WT a 30 micron MTX come mimica di protocolli clinici. È interessante notare che questa linea cellulare visualizzata anche una resistenza incrociata a Dex (risultati non pubblicati), per i quali il meccanismo non è del tutto chiaro.Il tum solidoo il modello studiato in questo studio è adenocarcinoma del dotto pancreatico, noto per la sua straordinaria refrattarietà alla chemioterapia. A questo scopo, abbiamo selezionato linea Panc-1 cellula e la sua gemcitabina resistente sub-clone Panc-1R ottenuta mediante incubazione continuo con 1 pM del farmaco 24. Qui si descrive un metodo per scoprire nuovi meccanismi alla base in vitro resistenza ai farmaci mediante la combinazione di tre protocolli: saggi di citotossicità colorimetrici per valutare la sensibilità ai farmaci nelle cellule leucemiche e cellule tumorali di tumori solidi, gasdotto RNA-Seq-based per identificare varianti di splicing nuovi legati alla la sensibilità ai farmaci / resistenza e RT-PCR e qRT-PCR per convalidare potenziali candidati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un nuovo approccio che combina tecniche di screening di citotossicità consolidate e potente trascrittomica NGS a base di analisi per identificare eventi di splicing differenziali in relazione alla resistenza ai farmaci. Analisi spettrofotometriche sono metodi high-throughput convenienti e affidabili per valutare la sensibilità ai farmaci in modelli tumorali in vitro e rappresentano la prima scelta per molti laboratori che effettuano proiezioni di citotossicità. Risoluzione dei problemi così …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
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