Ved hjelp av RNA-sekvensering for å oppdage Novel Splice Varianter Relatert til Drug Resistance in<em> In Vitro</em> Kreft Modeller

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å undersøke virkningen av avvikende spleising på legemiddelresistens i solide svulster og hematologisk malignitet. Til dette målet, analyserte vi transcriptomic profiler av foreldre og resistente in vitro modeller gjennom RNA-seq og etablert en QRT-PCR basert metode for å validere kandidat gener.

Abstract

Legemiddelresistens er fortsatt et stort problem i behandling av kreft både for hematologiske ondartede sykdommer og faste tumorer. Egenverdi eller ervervet resistens kan være forårsaket av en rekke mekanismer, blant annet økt narkotika eliminasjon, redusert medikamentopptak, narkotika inaktivering og endringer av narkotika mål. Nyere data viser at andre enn kjente genetiske (mutasjon, forsterkning) og epigenetisk (DNA hypermethylation, histon post-translasjonell modifikasjon) modifikasjoner, narkotika resistensmekanismer kan også være regulert av spleise avvik. Dette er et raskt voksende felt av etterforskningen som fortjener fremtiden oppmerksomhet for å planlegge mer effektive terapeutiske tilnærminger. Protokollen er beskrevet i denne artikkelen er rettet mot å undersøke virkningen av avvikende spleising på legemiddelresistens i solide svulster og hematologisk malignitet. Til dette målet, analyserte vi transcriptomic profiler av flere in vitro modeller gjennom RNA-seq og etablereed en QRT-PCR basert metode for å validere kandidat gener. Spesielt vurderte vi differensial skjøting av DDX5 og PKM transkripsjoner. Den avvikende spleising oppdaget av beregningsverktøyet MATS ble validert i leukemiceller, som viser at ulike DDX5 spleisevarianter er uttrykt i foreldre vs resistente celler. I disse cellene, vi også observert en høyere PKM2 / PKM1 ratio, som ikke ble oppdaget i Panc-en gemcitabin-resistente motstykke i forhold til foreldre Panc-1 celler, noe som tyder på en annen mekanisme av resistens indusert av gemcitabin eksponering.

Introduction

Til tross for betydelige fremskritt i cancer behandling, motstand av maligne celler til kjemoterapi, enten iboende eller ervervet etter forlenget medikamenteksponering, er den viktigste årsaken til behandlingssvikt hos et bredt spekter av leukemi og faste tumorer ^1.

For å avgrense de mekanismer som ligger til grunn for medikamentresistens in vitro, cellelinje-modeller er utviklet ved trinnvis utvalg av kreftceller som er resistente mot kjemoterapeutiske midler. Denne prosedyren etterligner regimene som brukes i kliniske settinger og derfor gjør grundig undersøkelse av relevante resistensmekanismer. Resistente celler som overlever behandlingen blir deretter skilles fra foreldre sensitive celler ved hjelp av celle levedyktighet / cytotoksisitetsassayer ^2. In vitro-medikamentresistensprofiler av primærceller har vist seg å være signifikant relatert til klinisk respons på kjemoterapi ^3.

Høy gjennomstrømming cytotoxicity assayer utgjør en praktisk metode for å bestemme medikamentsensitivitet in vitro. Heri blir levedyktigheten av celler bedømt ved for eksempel 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromid – MTT målings ^4, som er basert på metabolsk omdannelse av visse substrater (dvs. tetrazoliumsalter) inn fargede produkter, og derved reflekterer den mitokondrielle aktivitet celler. Alternativt kan den cellulære proteininnhold kvantifiseres ved å bruke sulforhodamin B (SRB) analyse ^5. Her er antallet av levedyktige celler som er proporsjonalt med den optiske tetthet (OD) målt ved en passende bølgelengde i et spektrofotometer, uten behov for omfattende og tidkrevende celletellingsfremgangsmåter. Veksten inhibering indusert ved en viss kjemoterapeutisk medikament kan beregnes på grunnlag av den ytre diameter av brønnene hvori cellene ble behandlet med en testmidlet og sammenlignes med OD for ubehandlede kontrollceller. En dose-responskurve er obtastilt ved plotting av medikamentkonsentrasjoner sammenlignet med prosentandelen av levende celler i forhold til kontrollceller. Endelig kan medikamentsensitivitet rapporteres som konsentrasjonen som resulterer i 50% av celleveksthemming sammenlignet med ubehandlede celler (IC _50).

Mekanismene bak legemiddelresistens omfatter mange ulike avvik, for eksempel endringer som påvirker genekspresjon av determinanter for narkotika aktivitet og cellenes stoffskifte. Disse molekylære lesjoner, inkludert mutasjoner, avvik på en transkripsjonen og post-transkripsjonsnivået samt forstyrret epigenetisk regulering ofte påvirke gener involvert enten i legemiddelmetabolismen eller apoptose ^6.

Alternative pre-mRNA spleising og dens intrikate regulering har nylig fått stor oppmerksomhet som en roman enhet som kan diktere narkotika motstand av kreftceller ^7. Opp til 95% av humane gener er alternativt spleiset i normale celler ved hjelp av dennetett regulert prosess som produserer mange forskjellige protein isoformer fra det samme genet. Alternativ spleising er ofte deregulert i kreft og flere svulster er preget av endrede spleising av et økende antall gener som er involvert i legemiddelmetabolisme (dvs. deoksycytidinkinase, folylpolyglutamate syntetase, eller multiresistens proteiner) ^6,8. Imidlertid er omfattende analyse av spleise profiler av medikamentresistente celler smertelig mangler. Derfor er det viktig å utvikle høy gjennomstrømning metoder for alternativ spleising analyse. Dette kan bidra til å utvikle mer effektive terapeutiske tilnærminger.

I løpet av det siste tiåret, har den raske utviklingen av neste generasjons sekvense (NGS) teknologier beriket biomedisinsk forskning med ny innsikt i de molekylære mekanismene som styrer reguleringen av genomet uttrykk og deres rolle i ulike biologiske prosesser ^9. RNA-sekvensering (RNA-seq) er en kraftig sub-søknadav NGS innen transcriptomics. Den tillater en genom-bred profilering (både kvalitativt og kvantitativt) av uttrykket mønstre av tusener av gener samtidig og er godt egnet for karakterisering av nye kodende mRNA, samt lang ikke-kodende RNA, miRNA, siRNA og andre små RNA klasser (f.eks snRNA og Pirna) ^10,11.

RNA-Seq har mange fordeler i forhold til tidligere teknologier for transkriptomet karakterisering (f.eks Sanger-sekvensering og ekspresjon mikromatriser). Det er ikke basert på eksisterende annotasjon av genomer, har det en enkelt-nukleotid nivået for oppløsning og den har et bredere dynamisk område for uttrykk nivå estimering. Kort fortalt, den grunnleggende eksperimentelle arbeidsflyten av RNA-seq eksperimenter består av polyadenylert transkripsjon (mRNA) utvalg og fragmentering, etterfulgt av konvertering til cDNA, bibliotek konstruksjon og til slutt, massivt parallell dypt sekvense ^12,13. På grunn av rask dråpe sequencing kostnader over de siste årene, RNA-seq gradvis erstatte andre teknologier og betydelig innsats blir gjort for å forbedre biblioteket forberedelse protokoller. For eksempel er det nå mulig å holde strengen informasjonen av mRNA-transkripter ved å merke den andre tråd cDNA med deoxyuridin trifosfat (dUTP) og, forut for PCR-amplifikasjon, bearbeider den merkede tråden med uracil-DNA-glycosilase (UDG). Denne prosessen forbedrer nøyaktigheten av genet merknader og estimering av uttrykket nivåer ^14,15.

Analyse og tolkning av RNA-seq data krever komplekse og kraftige beregningsprogramvarepakker og behandling innen bioinformatikk rørledninger ^16,17. Først leser den rå gjennomgå kvalitetskontroll ved å fjerne tekniske og biologiske gjenstander og deponering (trimming) sekvensene som ikke kommer strenge kvalitetskrav. Deretter leser for hver prøve er tilordnet til en referanse genom og indeksertinn i gen-nivå, ekson-nivå, eller transkript-nivå, for å bestemme den mengde av hver kategori. Avhengig av programmet, blir raffinert data så beregnet ved statistiske modeller for identifikasjon av allel-spesifikk uttrykk, alternativ spleising, Genfusjonene og enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) ^12. Endelig kan differensialanalyse av det valgte nivå (dvs. genekspresjon eller alternativ spleising) brukes til å sammenligne prøvene oppnådd under forskjellige betingelser.

Differensial skjøting analyse beskriver forskjellene i spleisesete bruken mellom to prøver. Stadig flere programvarepakker viet til dette formålet er tilgjengelige basert på ulike statistiske modeller, forestillinger og brukergrensesnitt ^18. Blant disse, MATS (multivariat analyse av transkripsjon skjøting) fremstår som en fritt tilgjengelig og presis beregningsverktøy basert på en bayesiansk statistisk rammeverk og designet for å oppdage differential spleise hendelser fra enten én eller sammenkoblede slutt RNA-seq data. Starter fra de flukt (.bam) filer, kan MATS oppdage alle store typer alternativ spleising hendelser (exon hoppe, alternativ 3 'spleisesete, alternativ 5' spleisesete, gjensidig utelukkende eksoner og intron oppbevaring – se også figur 1).

Først leser programvare identifiserer hvilke støtter en viss skjøt hendelse, for eksempel exon hopper over, og klassifiserer dem inn i to typer. "Inkludering leser" (for den kanoniske skjøten hendelse) kartlegge innenfor det undersøkte ekson og spenner overgangene mellom det spesifikke exon og de to oppstrøms og nedstrøms flanker eksoner. "Hoppe leser" (for det alternative spleise hendelse) spenner krysset mellom de to flanker eksoner. Deretter returnerer MATS normalisert inkludering nivå for begge de kanoniske og alternative arrangementer og sammenligner verdiene mellom prøver eller forhold. Til syvende og sist, beregner det P-verdi ennd falsk funnrate (FDR) forutsatt at forskjellen i varianten forholdet av et gen mellom to tilstander overskrider en gitt brukerdefinert terskel for hver skjøting arrangementet ^19,34.

Etter differensial skjøting analyse i forbindelse med RNA-seq, er en omfattende eksperimentell validering garantert for å identifisere sanne positive genet kandidater ^18. Kvantitativ revers transkribert-polymerase chain reaction (QRT-PCR) er den mest brukte og optimale metoden i validering av kandidater hentet fra RNA-Seq analyse ^20. Hensikten med denne artikkelen er å tilveiebringe en robust metode for å undersøke medikamentresistens relaterte skjøting profiler i faste tumorer og hematologiske maligniteter. Vår tilnærming benytter RNA-seq basert transkriptomet profilering av utvalgte cellelinje modeller av medikamentresistente kreftformer i kombinasjon med en etablert QRT-PCR-metode for validering av kandidatgener er implisert i medikamentresistens.

<p class = "jove_content"> The human leukemi cellelinje modeller brukt i denne studien inkluderte pediatrisk T-celle akutt lymfatisk leukemi (T-ALL) cellelinje CCRF-CEM (CEM-WT), sine to glukokortikoid (GC) motstandsdyktig subkloner CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) og CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 og metotreksat (MTX) motstandsdyktig underlinjen CEM / R30dm ^23. Selv om dagens behandlingsformer basert på GCer og MTX etablere klinisk nytte i ca 90% av tilfellene, fremveksten av GC-resistens utgjør fortsatt et uløst problem med en uklar molekylære mekanismen. For å isolere GC-resistente kloner sub-, CEM-WT-celler ble dyrket i 1 uM deksametason (Dex) i 2 til 3 uker. MTX-resistente underlinjen CEM / R30dm ble utviklet gjennom gjentatte korttids (24 timer) eksponering av CEM-WT celler til 30 mikrometer MTX som en etterligner av kliniske protokoller. Interessant, denne cellelinjen viste også kryssresistens til Dex (upubliserte resultater) for hvilken mekanisme ikke er fullt ut forstått.

Den faste tumeller modell undersøkt i denne studien er pancreatic ductal adenokarsinom, beryktet for sin ekstraordinære Ingen respons på kjemoterapi. For å oppnå dette, har vi valgt Panc-1-cellelinje og dens gemcitabin-resistente sub-klon Panc-1R erholdt ved kontinuerlig inkubasjon med 1 uM av stoffet ^24. Her beskriver vi en tilnærming til å oppdage nye mekanismene bak in vitro legemiddelresistens ved å kombinere tre protokoller: kolorimetriske cytotoksisitetsassayer å vurdere stoffet følsomhet i leukemiske celler og kreftceller fra solide tumorer RNA-seq basert rørledning til å identifisere nye spleisevarianter knyttet til medikamentsensitivitet / motstand og RT-PCR og QRT-PCR-analyse for å bekrefte potensielle kandidater.

Protocol

1. Karakterisering av resistens profiler gjennom cytotoksisitetsassayer Leukemicellelinje Culture Opprettholde den paren T-celle-ALL cellelinje CCRF-CEM (CEM-WT) så vel som dets medikament-resistente underlinjer, inkludert CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3, i 25 cm 2 i 10 ml RPMI-1640 medium innehold 2,3 uM folsyre supplert med 10% føtalt kalveserum og 100 enheter / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin. Kultur ble cellene i en fuktig atmosfære ved 37 ° C i…

Representative Results

De cytotoksisitetsanalyser er beskrevet i protokollen tilveiebringe en pålitelig og robust fremgangsmåte for å vurdere motstanden av kreftceller overfor kjemoterapeutiske midler in vitro. Ved hjelp av MTT-analysen, ble sensitiviteten til Dex bestemt i fire T-ALL-cellelinjer, blant annet Dex-følsomme paren CEM-WT celler og tre Dex-resistente underlinjer: CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3. To forskjellige konsentrasjonsområder måtte brukes på grunn av den store forskjellen i f?…

Discussion

Her beskriver vi en ny tilnærming som kombinerer veletablerte cytotoksisitetstester screening teknikker og kraftig NGS-baserte transcriptomic analyser for å identifisere differensialspleise hendelser i forhold til legemiddelresistens. Spektrofotometriske analyser er praktiske og robuste høy gjennomstrømming metoder for å vurdere stoffet følsomhet i in vitro kreft modeller og representerer det første valget for mange laboratorier som utfører cytotoksisitetstester screenings. Feilsøking samt mulige varia…

Materials

Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140