С помощью РНК-последовательности для обнаружения Novel сращивание Варианты, относящиеся к лекарственной устойчивости<em> In Vitro</em> Модели рака
Summary
Здесь мы опишем протокол, направленный на изучение влияния отклоняющегося сплайсинга на лекарственной устойчивости в солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Для этой цели, мы проанализировали транскриптомных профили родительских и устойчивых в лабораторных моделях через Секвенирование РНК и создал метод , основанный QRT-PCR для проверки генов – кандидатов.
Abstract
Устойчивость к лекарственным средствам остается главной проблемой в лечении рака для обоих гематологических злокачественных заболеваний и твердых опухолей. Характеристическая или приобретенное сопротивление может быть вызвано целым рядом механизмов, в том числе повышенной ликвидации наркотиков, снижение поглощения наркотиков, инактивацию наркотиков и изменения лекарственных мишеней. Последние данные показали, что помимо хорошо известной генетической (мутации, амплификации) и эпигенетических (гиперметилированием ДНК, гистонов посттрансляционной модификации) модификаций, механизмы устойчивости к лекарственным средствам также может регулироваться сплайсинга аберраций. Это быстро растущая область исследований, которая заслуживает внимания в будущем, чтобы планировать более эффективные терапевтические подходы. Протокол, описанный в этой статье, направлена на изучение влияния отклоняющегося сплайсинга на лекарственной устойчивости в солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Для этой цели, мы проанализировали транскриптомных профили нескольких моделей в пробирке через РНК-сл и установитьМетод, основанный Эду QRT-PCR для проверки генов-кандидатов. В частности, мы оценивали дифференциальный сплайсинг ddx5 и ПКМ транскриптов. Аберрантная сплайсинга обнаружен вычислительный инструмент MATS была подтверждена в лейкозных клетках, показывая, что различные варианты ddx5 сплайс выражены в резистентных клетках родительская против. В этих клетках, мы также наблюдали / соотношение PKM1 выше PKM2, который не был обнаружен в гемцитабин-резистентный аналог Рапс-1 по сравнению с родительскими клетками Рапс-1, что указывает на иной механизм лекарственной устойчивости, вызванной воздействием гемцитабина.
Introduction
Несмотря на значительные успехи в лечении рака, резистентности злокачественных клеток к химиотерапии, либо собственной или приобретенной при длительном воздействии наркотиков, является основной причиной неэффективности лечения в широком диапазоне лейкемии и солидных опухолей 1.
Для того , чтобы очертить механизмы , лежащие в основе устойчивости к лекарственным средствам, экстракорпоральное модели клеточной линии разработаны ступенчатого подбора раковых клеток , резистентных к химиотерапевтическим агентам. Эта процедура имитирует режимы, используемые в клинических условиях и, следовательно, позволяет в глубине исследования соответствующих механизмов сопротивления. Резистентные клетки , которые выживают лечение затем отличаются от родительских чувствительных клеток с использованием жизнеспособность клеток / цитотоксичности 2. В пробирке профилей лекарственной устойчивости первичных клеток было показано, что в значительной степени связано с клинической реакции на химиотерапию 3.
Высокая пропускная способность cytotoxicity анализы представляют собой удобный метод для определения лекарственной чувствительности в пробирке. При этом жизнеспособность клеток оценивают с помощью, например , 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенил тетразолия бромид – МТТ 4, который основан на метаболическом превращении некоторых субстратов (то есть, тетразолия соли) в окрашенных продуктов, тем самым отражая митохондриальную активность клеток. В качестве альтернативы, клеточное содержание белка может быть определена количественно с помощью анализа 5 сульфородамина В (SRB). Здесь, количество жизнеспособных клеток пропорциональна оптической плотности (OD), измеренной при соответствующей длине волны на спектрофотометре, без необходимости обширный и отнимает много времени процедуры подсчета клеток. Ингибирование роста, индуцированный определенным химиотерапевтического препарата может быть рассчитана на основе OD лунок, в которых клетки были обработаны с тестируемым агентом и по сравнению с наружным диаметром необработанными контрольными клетками. Кривая доза-ответ obtaIned путем построения графика концентрации лекарственного средства в сравнении с процентным содержанием жизнеспособных клеток по сравнению с контрольными клетками. И, наконец, чувствительности к лекарственным препаратам может быть сообщено как концентрация , которая приводит к 50% ингибированию роста клеток по сравнению с необработанными клетками (IC 50).
Механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости включают много различных патологий, таких как изменения, влияющих на экспрессию генов, определяющих активности лекарственного средства и клеточного метаболизма. Эти молекулярные повреждения, в том числе мутаций, аберраций в транскрипции и пост-транскрипционном уровне, а также нарушенного эпигенетической регуляции часто влияют на гены , участвующие в обмене веществ либо наркотиков или апоптоза 6.
Альтернативное пре-мРНК , сплайсинг и его запутанный регулирование недавно получили значительное внимание в качестве нового объекта , который может продиктовать устойчивости к лекарственным средствам раковых клеток 7. До 95% человеческих генов подвергаются альтернативному сплайсингу в нормальных клетках с помощью этогожестко регулируется процесс, который производит много различных изоформы белка из того же гена. Альтернативный сплайсинг часто дерегулированы при раке и несколько опухолей характеризуются измененном сплайсинга растущего числа генов , участвующих в метаболизме лекарственных средств (т.е. дезоксицитидинкиназой, folylpolyglutamate синтетазы или белков множественной лекарственной устойчивости) 6,8. Тем не менее, всесторонний анализ сплайсинга профилей резистентных клеток наркотиков мучительно не хватает. Поэтому крайне важно развивать высокие методы пропускной способности для альтернативного анализа сплайсинга. Это могло бы помочь разработать более эффективные терапевтические подходы.
В течение последнего десятилетия, быстрое развитие следующего поколения секвенирования (NGS) технологий обогатила биомедицинские исследования с новому взглянуть на молекулярные механизмы , регулирующие регуляции экспрессии генома и их роль в различных биологических процессах 9. РНК-секвенирование (РНК-сл) является мощным субприложениеиз НГС в области транскриптомику. Это позволяет геному профилирование (качественно и количественно) из паттернов экспрессии тысяч генов одновременно и хорошо подходит для характеристики новых мРНК, кодирующих, а также длинные РНК некодирующие, микроРНК, миРНК и другие малые РНК классы (например, мяРНК и Пирна) 10,11.
Секвенирование РНК имеет много преимуществ по сравнению с предыдущими технологиями для транскриптома характеристик (например, Sanger секвенирования и экспрессии микрочипов). Она не основана на существующих генома аннотацию, он имеет уровень однонуклеотидных резолюции, и она имеет более широкий динамический диапазон для оценки уровня экспрессии. Вкратце, основной экспериментальный рабочий процесс РНК-последовательность SEQ экспериментов состоит из Полиаденилированная транскриптов (мРНК) селекции и фрагментации, с последующим превращением в кДНК, строительство библиотеки и , наконец, с массовым параллелизмом глубокого секвенирования 12,13. Из-за быстрого падения sequencinг затраты в течение последних нескольких лет, Секвенирование РНК постепенно заменяют другие технологии и значительные усилия предпринимаются для улучшения протоколов подготовки библиотеки. Например, теперь можно сохранить информацию о прядей транскриптов мРНК путем маркировки второй цепи кДНК с дезоксиуридина трифосфата (дУТФ) и, перед ПЦР-амплификации, переваривая отмеченное прядь с урацил-ДНК-glycosilase (UDG). Этот процесс повышает точность гена аннотацию и оценки уровней экспрессии 14,15.
Анализ и интерпретация РНК-сл данных требует сложных и мощных вычислительных пакетов программного обеспечения и обработки в пределах биоинформатики трубопроводов 16,17. Во-первых, сырые читает прошли контроль качества посредством устранения технических и биологических артефактов и отбрасывания (обрезки) последовательности, которые не достигают строгим требованиям к качеству. Впоследствии считывает для каждого образца сопоставляются с референсный геном и индексированыв генного уровня, экзон-уровня или транскрипта уровня, для того, чтобы определить содержание каждой категории. В зависимости от применения, Уточненные данные затем вычисляются с помощью статистических моделей для идентификации аллель-специфической экспрессии, альтернативного сплайсинга, ген слитых и одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) 12. И, наконец, дифференциальный анализ на выбранном уровне (т.е. экспрессии гена или альтернативного сплайсинга) могут быть использованы для сравнения образцов , полученных при различных условиях.
Дифференциальный анализ сплайсинг описывает различия в использовании сайтов сплайсинга между двумя образцами. Все большее число программных пакетов , посвященных этой цели доступны на основе различных статистических моделей, представления и пользовательского интерфейса 18. Среди них, ЦИНОВКИ (Многофакторный анализ транскрипция сплайсинга) выступает как свободно доступной и точной вычислительный инструмент на основе байесовской статистической системы и предназначен для обнаружения сиситемахrential сплайсинга события из одиночные или спаренных концевых РНК-сл данных. Начиная с совмещенными файлов (.bam), Матс может обнаружить все основные виды альтернативного сплайсинга событий (пропуск экзонов, альтернативного сплайсинга "сайта, альтернативного 5 '3 сайта сплайсинга, взаимоисключающих экзонов и интронов удержания – также смотрите Рисунок 1).
Во-первых, программное обеспечение идентифицирует читает, которые поддерживают определенное событие сплайсинга, например пропуск экзонов, и классифицирует их на два типа. "Включение чтения" (для канонического события сплайсинга) карту в исследуемом экзона и охватывают соединений между этой конкретной экзона и двух вверх и вниз по фланкирующих экзоны. "Пропускаем читает" (для альтернативного сплайсинга события) перекрывают соединение между двумя фланкирующих экзоны. Впоследствии ЦИНОВКИ возвращает нормализованное уровень включения как для канонического и альтернативных событий и сравнивает значения между образцами или условиями. В конечном счете, он вычисляет P-значение ай уровень ложных обнаружения (ФДР) в предположении , что разница в соотношении вариант гена между двумя условиями превышает заданный пользователем порог для каждого события сплайсинга 19,34.
После дифференциального анализа сплайсинга в сочетании с Секвенирование РНК, обширная экспериментальная проверка является оправданным с целью выявления истинного положительных кандидатов 18 генов. Количественные обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (QRT-ПЦР) является наиболее широко используемым и оптимальный метод в проверке кандидатов , полученных из РНК-Seq анализа 20. Целью данной работы является создание надежной методологии для исследования наркотиков сопротивления связанных профилей сплайсинга солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Наш подход использует РНК-ПОСЛ на основе транскриптом профилирование отдельных моделей клеточной линии рака лекарственной устойчивостью в сочетании с установленным методом QRT-PCR для проверки генов-кандидатов, замешанных в лекарственной устойчивости.
<p class = "jove_content"> Модели клеточной линии лейкемии человека, используемые в данном исследовании, включали педиатрической Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ) линия клеток CCRF-CEM (СЕМ-WT), его два глюкокортикоид (ГХ) резистентные субклоны СЕМ -C7H2-R5C3 (СЕМ-С3) и CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 и метотрексата (МТХ) резистентные подлиния CEM / R30dm 23. Хотя современные методы лечения, основанные на ШС и МТХ установить клиническое преимущество примерно в 90% случаев, появление GC-сопротивления по-прежнему представляет собой нерешенная проблема с нечетким молекулярного механизма. Для того, чтобы изолировать GC-резистентный суб-клонов, СЕМ-WT-клетки культивировали в 1 мкМ дексаметазона (DEX) в течение 2-х до 3-х недель. МТХ-устойчивые подлиния CEM / R30dm была разработана на основе повторных краткосрочных (24 ч) воздействия на клетки CEM-WT до 30 мкм МТХ как подражанием клинических протоколов. Интересно, что эта клеточная линия также отображается перекрестная резистентность к Dex (неопубликованные результаты), для которых механизм до конца не изучен.Твердое тумили модели исследованы в настоящем исследовании, является панкреатический протоковой аденокарциномы, известный своей необычайной рефрактерности к химиотерапии. С этой целью мы выбрали линию Рапс-1 клетки и ее гемцитабин устойчивостью суб-клон Рапс-1Р , полученный путем непрерывной инкубации с 1 мкМ препарата 24. Здесь мы опишем подход , чтобы обнаружить новые механизмы , лежащие в основе экстракорпоральное лекарственной устойчивости путем объединения трех протоколов: колориметрические цитотоксичности для оценки лекарственной чувствительности в лейкозных клетках и раковых клеток из солидных опухолей, РНК-сл на основе трубопровода , чтобы идентифицировать новые варианты сплайсинга , связанные с лекарственную чувствительность / сопротивление и ОТ-ПЦР и анализ QRT-PCR для проверки потенциальных кандидатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем новый подход, который сочетает в себе хорошо зарекомендовавшие себя методы скрининга цитотоксичности и мощный NGS на основе транскриптомики анализа для выявления дифференциальных сплайсинга событий по отношению к лекарственной устойчивости. Спектрофотометрические а?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
