Användning av RNA-sekvensering för att upptäcka Novel Splice varianter besläktade med drogmotstånd i<em> In Vitro</em> Cancer modeller

Summary

Här beskriver vi ett protokoll som syftar till att undersöka effekten av avvikande splitsning på läkemedelsresistens i solida tumörer och hematologiska maligniteter. Till detta mål, analyserade vi transcriptomic profiler föräldra och resistenta in vitro-modeller genom RNA-punkter och etablerat en QRT-PCR-baserad metod för att validera kandidatgener.

Abstract

Läkemedelsresistens är fortfarande ett stort problem i behandlingen av cancer för både hematologiska maligniteter och solida tumörer. Inneboende eller förvärvad resistens kan orsakas av en rad mekanismer, inklusive ökad eliminering läkemedel, minskad läkemedelsupptag, droginaktivering och förändringar av läkemedelsmål. De senaste uppgifterna visar att annat sätt än genom välkända genetiska (mutation, förstärkning) och epigenetiska (DNA hypermethylation, histon posttranslationell modifiering) ändringar, läkemedelsresistensmekanismer kan också regleras genom splits avvikelser. Detta är ett snabbt växande område som ska undersökas som förtjänar framtida uppmärksamhet för att planera mer effektiva behandlingsmetoder. Protokollet som beskrivs i detta dokument syftar till att undersöka effekten av avvikande splitsning på läkemedelsresistens i solida tumörer och hematologiska maligniteter. Till detta mål, analyserade vi transcriptomic profiler i flera in vitro-modeller genom RNA-punkter och fastställaed en QRT-PCR-baserad metod för att validera kandidatgener. Framför allt utvärderade vi differentiell splitsning av DDX5 och PKM transkript. Den avvikande splitsning detekteras av beräkningsverktyg MATS validerades i leukemiceller, vilket visar att olika DDX5 splitsvarianter uttrycks i föräldra vs. resistenta celler. I dessa celler, observerade vi också en högre PKM2 / PKM1-förhållande, vilket inte detekterades i Panc-1 gemcitabin-resistent motsvarighet jämfört med parentala Panc-1-celler, vilket tyder på en annan mekanism av läkemedelsresistens inducerad av gemcitabin exponering.

Introduction

Trots betydande framsteg inom cancerbehandling, motstånd av maligna celler för kemoterapi, antingen inneboende eller förvärvad vid långvarig läkemedelsexponering, är den främsta orsaken till behandlingssvikt i ett brett spektrum av leukemi och solida tumörer ^1.

I syfte att avgränsa de mekanismer som ligger bakom drogmotstånd, in vitro cell line modeller utvecklas genom stegvis urval av cancerceller som är resistenta mot kemoterapeutiska medel. Detta förfarande efterliknar regimerna som används i kliniska och därför tillåter djupgående undersökning av relevanta resistensmekanismer. Resistenta celler som överlever behandlingen sedan skiljas från föräldra känsliga celler genom att använda cellviabiliteten / cytotoxicitetsanalyser ^2. I läkemedelsresistens vitro profiler av primära celler har visat sig vara signifikant relaterade till kliniskt svar på kemoterapi ^3.

Hög genomströmning cytotoxicity analyser utgör en lämplig metod för att bestämma läkemedelskänslighet in vitro. Häri, är livskraften hos cellerna utvärderas av exempelvis 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid – MTT-analys ^4, vilket är baserat på metabolisk omvandling av vissa substrat (dvs., tetrazoliumsalter) till färgade produkter och därigenom återspegla den mitokondriella aktiviteten hos celler. Alternativt kan det cellulära proteininnehållet kvantifieras med hjälp av sulforodamin B (SRB) -analys ^5. Här, är antalet livskraftiga celler som är proportionell mot den optiska densiteten (OD) mätt vid en lämplig våglängd i en spektrofotometer, utan behov av omfattande och tidskrävande cellräkningsförfaranden. Den tillväxtinhibering som orsakas av en viss kemoterapeutiskt läkemedel kan beräknas baserat på den OD av brunnarna i vilka cellerna behandlades med ett testmedel och jämfört med OD för obehandlade kontrollceller. En dos-responskurva är obtasökte genom plottning läkemedelskoncentrationer kontra procentsatser av livsdugliga celler i förhållande till kontrollceller. Slutligen kan läkemedelskänslighet rapporteras som den koncentration som resulterar i 50% av celltillväxthämning jämfört med obehandlade celler _(IC50).

Mekanismerna bakom läkemedelsresistens omfattar många olika avvikelser, till exempel förändringar som påverkar genuttrycket av bestämningsfaktorer för läkemedelsaktivitet och cellmetabolism. Dessa molekylära lesioner, inklusive mutationer, avvikelser vid en transkriptions och posttranskriptionsnivå samt störd epigenetisk reglering påverkar ofta gener involverade antingen i läkemedelsmetabolism eller apoptos ^6.

Alternativa pre-mRNA-splitsning och dess invecklade lagstiftning har nyligen fått stor uppmärksamhet som en ny enhet som kan diktera läkemedelsresistens hos cancerceller ^7. Upp till 95% av humana gener är alternativt splitsad i normala celler med hjälp av dennahårt reglerad process som producerar många olika protein isoformer från samma gen. Alternativ splitsning är ofta avreglerades cancer och flera tumörer kännetecknas av förändrade splitsning av ett växande antal gener som är involverade i läkemedelsmetabolism (dvs deoxycytidinkinas, folylglutamatsyntetas eller multiresistens proteiner) ^6,8. Dock är omfattande analys av splits profiler av läkemedelsresistenta celler plågsamt saknas. Därför är det viktigt att utveckla hög genomströmning metoder för alternativ splitsning analys. Detta skulle kunna bidra till att utveckla mer effektiva behandlingsmetoder.

Under det senaste decenniet har den snabba utvecklingen av nästa generations sekvensering (NGS) teknik berikat biomedicinsk forskning med nya insikter i de molekylära mekanismer som styr regleringen av genomet uttryck och deras roll i olika biologiska processer ^9. RNA-sekvensering (RNA-punkter) är ett kraftfullt under ansökanav NGS inom transkriptomik. Det gör att en genomet hela profilering (både kvalitativt och kvantitativt) av uttrycksmönster tusentals gener samtidigt och är väl lämpad för karakterisering av nya kodnings mRNA liksom långa icke-kodande RNA, miRNA, siRNA och andra små RNA klasser (t.ex. snRNA och Pirna) ^10,11.

RNA-Seq har många fördelar jämfört med tidigare teknik för transkriptom benämning (t.ex. Sanger-sekvensering och uttryck microarrays). Det är inte baserat på befintlig genom anteckning, har en enda nukleotid nivå på upplösning och har ett bredare dynamiskt omfång för uttrycksnivån uppskattning. I korthet, den grundläggande experimentella arbetsflödet av RNA-punkter experiment består av polyadenylerat transkript (mRNA) val och fragmentering, följt av omvandling till cDNA bibliotekskonstruktion och slutligen massivt parallell djup sekvensering ^12,13. På grund av snabb droppe sequencing kostnader under de senaste åren, RNA-punkter successivt ersätta andra tekniker och betydande ansträngningar görs för att förbättra förberedelserna bibliotek protokoll. Till exempel, är det nu möjligt att behålla Strand Information om mRNA-transkript genom att markera den andra strängen cDNA med deoxiuridintrifosfat (dUTP) och före PCR-förstärkning, smälta den markerade strängen med uracil-DNA-glycosilase (UDG). Denna process förbättrar noggrannheten hos genen annotering och uppskattning av de expressionsnivåer ^14,15.

Analys och tolkning av RNA-punkter data kräver komplexa och kraftfulla beräknings programpaket och bearbetning inom bioinformatiska rörledningar ^16,17. Först läser den råa genomgår kvalitetskontroll genom att undanröja tekniska och biologiska artefakter och kasta (trimning) sekvenserna som inte når höga kvalitetskrav. Därefter läser för varje prov mappas till en referens genomet och indexerasi gen-nivå, exon-nivå, eller transkript-nivå, i syfte att bestämma överflödet av varje kategori. Beroende på användningsområde, är raffinerade uppgifter sedan beräknas genom statistiska modeller för identifiering av allelspecifik uttryck, alternativ splitsning, genfusioner och single nucleotide polymorphisms (SNP) ^12. Slutligen kan differentialanalys på vald nivå (det vill säga, genuttryck eller alternativ splitsning) användas för att jämföra prov som erhållits under olika förhållanden.

Differentiell splitsning analysen beskrivs skillnaderna i splitsstället användning mellan två prover. Ett ökande antal av programvarupaket som ägnas åt detta ändamål finns baserade på olika statistiska modeller, uppträdanden och användargränssnitt ^18. Bland dessa, MATS (multivariat analys av avskrift Skarvning) framstår som en fritt tillgänglig och exakt beräkningsverktyg baserat på en Bayesiansk statistisk ram och utformat för att upptäcka differential splitsningshändelser från antingen enkla eller parade end RNA-punkter data. Utgående från de inriktade (.bam) filer, kan MATS upptäcka alla större typer av alternativa splitsningar (exon hoppa, alternativ 3 'splitsstället, alternativ 5' splitsstället, ömsesidigt uteslutande exoner och intron behålla – även se Figur 1).

Först läser mjukvaru identifierar som stöder en viss skarv händelse, till exempel exon hoppa, och klassificerar dem i två typer. "Inclusion läser" (för den kanoniska skarv händelse) kartlägga inom den undersökta exon och spänner över korsningar mellan den specifika exon och de två uppströms och nedströms flankerande exon. "Skipping läser" (för den alternativa splitsningshändelse) spänna över föreningspunkten mellan de två flankerande exoner. Därefter MATS returnerar normaliserade inblandning för både kanoniska och alternativa händelser och jämför värden mellan prover eller villkor. I slutändan, beräknar det P-värde and falsk upptäckten hastighet (FDR) under antagande att skillnaden i varianten förhållande av en gen mellan två villkor överskrider ett givet användardefinierad tröskel för varje skarvnings händelse ^19,34.

Efter differentiell splitsning analys i samband med RNA-punkter, är en omfattande experimentell validering motiverat för att identifiera sant positiva gen kandidater ^18. Kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) är den vanligaste och optimal metod validering av kandidater som erhållits från RNA-Seq analys ^20. Syftet med detta dokument är att ge en robust metod för att undersöka drogresistenta relaterade skarvning profiler i solida tumörer och hematologiska maligniteter. Vår strategi använder RNA-artiklar baserade transkriptom profilering av utvalda cellinje modeller av läkemedelsresistenta cancerformer i kombination med ett etablerat QRT-PCR-metod för validering av kandidatgener som är inblandade i läkemedelsresistens.

<p class = "jove_content"> De humana leukemicellinje modeller som används i denna studie inkluderade pediatriska T-cell-akut lymfoblastisk leukemi (T-ALL) cellinjen CCRF-CEM (CEM-WT), dess två glukokortikoid (GC) -resistent subkloner CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) och CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 och metotrexat (MTX) -resistenta sublinje CEM / R30dm ^23. Även om nuvarande terapier baserade på GC och MTX etablera klinisk nytta i ca 90% av fallen, representerar uppkomsten av GC-motstånd fortfarande ett olöst problem med en oklar molekylär mekanism. För att isolera GC-resistenta sub-kloner, CEM-WT-celler odlades i 1 | iM dexametason (Dex) under 2 till 3 veckor. MTX-resistenta underlinje CEM / R30dm utvecklades genom upprepad korttids (24 h) exponering av CEM-WT-celler till 30 iM MTX som en imitatör av kliniska protokoll. Intressant, denna cellinje visas också korsresistens mot Dex (opublicerade resultat) för vilken mekanismen inte är helt klarlagd.

Den fasta tumeller modell undersökts i denna studie är pankreas duktal adenokarcinom, ökänd för sin extraordinära refraktäritet för kemoterapi. För detta ändamål valde vi Panc-1-cellinjen och dess gemcitabin resistent subklon Panc-1R som erhållits genom kontinuerlig inkubering med 1 | iM av läkemedlet ^24. Här beskriver vi en metod för att upptäcka nya mekanismer som ligger bakom in vitro läkemedelsresistens genom kombination av tre protokoll: kolorimetriska cytotoxicitetsanalyser för att bedöma läkemedelskänslighet i leukemiceller och cancerceller från solida tumörer, RNA-seq baserade rörledningen för att identifiera nya splitsvarianter relaterade till läkemedelskänslighet / resistens och RT-PCR och QRT-PCR-analys för att validera potentiella kandidater.

Protocol

1. Karaktärisering av läkemedelsresistens profiler genom cytotoxicitetsanalyser Leukemisk cellinje Culture Bibehålla den paren T-cell-ALL-cellinjen CCRF-CEM (CEM-WT) samt dess läkemedelsresistenta sublinjer, inklusive CEM / R30dm, CEM-R5 och CEM-C3, i 25 cm 2 i 10 ml RPMI-1640-medium innehållande 2,3 | iM folsyra kompletterat med 10% fetalt kalvserum och 100 enheter / ml penicillin G och 100 | ig / ml streptomycin. Odla cellerna i en fuktad atmosfär vid 37 …

Representative Results

De cytotoxicitetsanalyser beskrivs i protokollet tillhandahåller en tillförlitlig och robust metod för att bedöma motståndet hos cancerceller för kemoterapeutiska medel in vitro. Med hjälp av MTT-analysen, var känsligheten för Dex bestämdes i fyra T-ALL-cellinjer, inklusive Dex-känsliga paren CEM-WT-celler och tre Dex-resistenta sublinjer: CEM / R30dm, CEM-R5 och CEM-C3. Två olika koncentrationsområden måste användas på grund av den stora skillnaden i känslighet…

Discussion

Här beskriver vi en ny metod som kombinerar väletablerade cytotoxicitet screeningstekniker och kraftfull NGS-baserade transcriptomic analyser för att identifiera differentialsplitsningar i förhållande till läkemedelsresistens. Spektrofotometriska analyser är praktiska och robusta hög genomströmning metoder för att bedöma läkemedelskänslighet i in vitro-modeller cancer och representerar det första valet för många laboratorier som utför cytotoxicitet visningar. Felsökning samt möjliga variation…

Materials

Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140