detectie van<em> Trypanosoma brucei</em> Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

De protozoa parasiet, Trypanosoma brucei, is een verwekker van ziekten die de mens beïnvloeden (via Trypanosoma brucei gambiense en Trypanosoma brucei rhodesiense) en dieren (via Trypanosoma brucei brucei) gehele Sub-Sahara Afrika. Het is aan de zoogdiergastheer overgedragen via het speeksel van de tseetseevlieg vector. Zowel mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis leiden tot een ernstige economische last in endemische gebieden, en weinig drugs zijn beschikbaar of in ontwikkeling voor de behandeling van beide ziekten. Inzicht in de mechanismen van immune fraude is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor trypanosomiasis. Antigene variatie van het dichte, variant oppervlakte glycoproteïne (VSG) jas die de parasiet bedekt, is een van de belangrijkste manieren waarop T. brucei ontwijkt de zoogdier antilichaam respons. Ongeveer 2000 varianten van de VSG-gen aanwezig in het genoom trypanosoom, maar slechts één wordt getranscribeerd op een bepaald moment uit een van ~ 15 expresSion sites. Switching van de VSG expressie kan plaatsvinden hetzij door het kopiëren van een VSG gen in de actieve expressie plaatsen of door transcriptionele activering van een eerder stille expressieplaats (besproken in ^1).

Hoewel veel werk is besteed aan het begrip van antigene variatie in T. brucei, de factoren die van invloed schakelfrequentie zijn nog steeds slecht begrepen. Studies tot op heden belemmerd door het feit dat hoewel omschakelen gebeurt stochastisch in vitro schakelfrequenties zeer laag, in de orde van 1 op ongeveer 10 ⁶ cellen ^2. Dit maakt het moeilijk te meten of een bepaalde factor verhoogt of verlaagt schakelfrequentie, omdat schakelen moeilijk te detecteren in de eerste plaats. Voorafgaand aan 2009, werkwijzen voor het isoleren overstappers in een bepaalde populatie waren langdurig en arbeidsintensief. Deze omvatten passeren van trypanosomen door de muizen ingeënt tegen de dominante VSG en dan oogsten van celleneen dag later ^3, en tellen honderden cellen door immunofluorescentie ^4,5. Een andere strategie is gebaseerd op selectie voor drug resistentie tegen switchers ⁶ isoleren. Omdat Afrikaanse trypanosomen gekweekt in vitro gewoonlijk bestaan uit een grote populatie expressie één belangrijke variant, en een veel kleinere populatie overstappers expressie alternatieve varianten wordt verwezen naar de belangrijkste variant in dit document als dominante vanaf VSG. Daarbij we geenszins willen impliceren dat deze belangrijke variant een grotere geschiktheid dan andere varianten in de populatie.

Hier beschrijven we een werkwijze die betrouwbaar het aantal trypanosomen expressie een niet-dominante VSG in een bepaalde populatie te meten 3 – 4 uur. Deze werkwijze is bijzonder bruikbaar wanneer men wil nagaan of een bepaalde genetische manipulatie of medicatie verhoogt het aantal geschakelde cellen in een populatie. In plaats van bevrijden de populatie van cellen die de dominant Neem VSG door middel van drugs of immunologische middelen, worden deze cellen geëlimineerd door eerst te coaten met magnetische korrels gekoppelde antilichaam tegen de dominante VSG en isoleren ze op een magnetische kolom. De geschakelde populatie wordt vervolgens verzameld in de doorstroom en opnieuw gekleurd met een fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG verontreinigingen identificeren. Kwantificering wordt bereikt door een bepaald aantal absolute tellen van kralen toevoegen aan elk monster zodat de verhouding van kralen cellen kan worden bepaald en gebruikt om het aantal overstappers kwantificeren de bevolking ^7.

Protocol

OPMERKING: Gedurende de procedure moet worden cellen op ijs bewaren. Koude media moeten ook overal worden gebruikt. 1. Sample Oogsten Lister stam groeien 427 bloedstroom trypanosomen tot een dichtheid van 0,5-1.000.000 / ml. Het beste is om culturen te starten met een klein aantal parasieten. Spin down 50 x 10 6 cellen / monster gedurende 10 min bij 1500 x g. Zorg ervoor dat u 1 x 10 6 cellen te laten in de cultuur voor later te gebruiken als positieve en neg…

Representative Results

De hier beschreven methode werd gebruikt om aan te tonen dat dubbelstrengs breuken in de VSG expressieplaats verhoogde het aantal overstappers in een populatie 8. Hier tonen we representatieve resultaten uit een populatie van trypanosomen die op soortgelijke wijze zijn opgewekt om een ​​dubbele breuken aan de uitdrukking website te genereren. Vergelijken we deze trypanosomen die die niet zijn geïnduceerd om een dubbelstrengs breuken gegenereerd. Figuur 1 …

Discussion

Wat experimentele techniek, is de meest kritische component van het protocol houden alle monsters koude. Trypanosomen zeer snel internaliseren antilichaam gebonden aan hun oppervlak ^9, maar dit proces is afhankelijk motiliteit, en heeft geen invloed op de bepaling zolang de cellen bij 4 ° C gehouden. Alle monsters moeten altijd worden bewaard op ijs, en pipetteren moet snel worden gedaan om de blootstelling aan de 25 ° C lab milieu te minimaliseren. Koud HMI-9 met serum moet beschikbaar zijn bij het begin v…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a