détection de la<em> Trypanosoma brucei</em> Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

Le parasite protozoaire, Trypanosoma brucei, est un agent causal de maladies qui affectent les humains (via Trypanosoma brucei gambiense et Trypanosoma brucei rhodesiense) et les animaux (via Trypanosoma brucei brucei) dans toute l' Afrique sub-saharienne. Elle est transmise à l'hôte de mammifère par la salive du vecteur de la mouche tsé-tsé. Les deux humains et de la trypanosomiase animale africaine causent un fardeau économique sévère dans les régions endémiques, et peu de médicaments sont disponibles ou en développement pour traiter soit la maladie. mécanismes d'évasion immunitaire Comprendre est critique pour le développement de médicaments pour la trypanosomiase. La variation antigénique du dense, la variante glycoprotéine de surface (VSG) manteau qui couvre le parasite est l' un des principaux moyens par lesquels T. brucei soustrait la réponse d'anticorps de mammifère. Environ 2,000 variants du gène de VSG existent dans le génome du trypanosome, mais un seul est transcrit à un moment donné de l' une des ~ 15 expressites sion. «Switching» de la VSG exprimée peut se produire soit par copie d' un gène de VSG dans le site actif d'expression, soit par activation de la transcription d'un site d'expression précédemment silencieux (passé en revue dans ^1).

Bien que beaucoup de travail a été consacrée à la compréhension de la variation antigénique de T. brucei, les facteurs qui influent sur la fréquence de commutation sont encore mal compris. Les études menées à ce jour ont été entravés par le fait que , bien que la commutation se produit stochastiquement in vitro, des fréquences de commutation sont très faibles, de l'ordre de 1 à environ 10 ⁶ cellules ^2. Cela rend difficile de mesurer si une augmentation de facteurs donnés ou diminue la fréquence de commutation, étant donné que la commutation est difficile à détecter en premier lieu. Avant 2009, les méthodes d'isolement switchers dans une population donnée étaient longues et de main-d'œuvre. Ces cellules repiquage trypanosomes par des souris immunisées contre la VSG dominante et récolte inclusun jour plus tard ^3, ou de compter des centaines de cellules par immunofluorescence ^4,5. Une autre stratégie repose sur la sélection pour la résistance aux médicaments pour isoler switchers ^6. Parce que les trypanosomes africains cultivées in vitro sont généralement constitués d'une grande population exprimant une variante importante, et une population beaucoup plus petite de switchers exprimant des variantes alternatives, nous nous référons à la principale variante dans le présent document comme, VSG à partir dominante. Ce faisant, nous voulons en aucun cas impliquer que cette variante majeure a une plus grande remise en forme que d'autres variantes dans la population.

Nous décrivons ici une méthode qui peut mesurer de manière fiable le nombre de trypanosomes exprimant une VSG non dominante dans une population donnée dans 3 – 4 h. Cette méthode est particulièrement utile lorsque l'on veut déterminer si une manipulation génétique donnée ou un traitement médicamenteux augmente le nombre de cellules commutées dans une population. Au lieu de se débarrasser de la population de cellules exprimant le dominant, à partir VSG par des médicaments ou par des moyens immunologiques, ces cellules sont éliminées en premier les enrobant avec des billes magnétiques couplées à un anticorps dirigé contre la VSG dominante, puis de les isoler dans une colonne magnétique. La population commuté est ensuite recueillie dans le flux continu et coloré à nouveau avec un anticorps marqué anti-VSG fluorophore pour identifier les contaminants. La quantification est obtenue en ajoutant un nombre défini de billes de comptage absolu de chaque échantillon de telle sorte que le rapport des billes aux cellules peut être déterminée et utilisée pour quantifier le nombre de commutateurs dans la population ^7.

Protocol

NOTE: Tout au long de la procédure, il est nécessaire de garder les cellules sur la glace. les médias froids doivent également être utilisés tout au long. 1. Récolte de l'échantillon Cultivez Lister 427 trypanosomes souche de la circulation sanguine à une densité de 0,5 – 1 million / ml. Il est préférable de commencer les cultures avec un petit nombre de parasites. Isoler 50 x 10 6 cellules / échantillon pendant 10 min à 1500 x g. Assurez – vous de lai…

Representative Results

La méthode décrite ici a été utilisé pour démontrer que les cassures double brin dans le site d'expression de VSG augmenté le nombre de switchers dans une population 8. Ici, nous montrons des résultats représentatifs d'une population de trypanosomes qui ont été induites de manière similaire pour générer une cassure double brin au niveau du site d'expression. Nous comparons ces trypanosomes à ceux qui ne l' ont pas été amené à générer une ca…

Discussion

En ce qui concerne la technique expérimentale, le composant le plus critique du protocole est de garder tous les échantillons froids. Les trypanosomes intérioriser très rapidement anticorps lié à leur surface ^9, mais ce processus dépend de la motilité, et n'a pas d' influence l'essai aussi longtemps que les cellules sont maintenues à 4 ° C. Tous les échantillons doivent toujours être sur la glace, et pipetage devraient être effectués rapidement pour minimiser l'exposition à l&#3…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a