обнаружение<em> Trypanosoma brucei</em> Вариант поверхности гликопротеин Переключение с помощью магнитных Активированный сортировки клеток и проточной цитометрии
Summary
African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.
Abstract
Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.
Introduction
Простейшим паразитом, Trypanosoma brucei, является возбудителем заболеваний , которые влияют на людей (через Trypanosoma brucei gambiense и Trypanosoma brucei rhodesiense) и животных (через Trypanosoma brucei brucei) во всей Африке к югу от Сахары. Он передается хозяину млекопитающего через слюну цеце вектора мухи. Оба человека и животных Африканский трипаносомоз вызывают серьезное экономическое бремя в эндемичных районах, а также несколько препаратов доступны или в развитии для лечения этих болезней. Понимание механизмов иммунной уклонения имеет решающее значение для разработки лекарств для трипаносомозу. Антигенная изменчивость плотного вариантные покрытия поверхности гликопротеина (VSG) , который покрывает паразита является одним из основных средств , с помощью которых Т. brucei уклоняется реакции антитела млекопитающих. Около 2000 вариантов гена VSG существуют в геноме трипаносом, но только один транскрибируется в любой момент времени от одного из ~ 15 Expresсайты Sion. "Переключение" выраженного VSG может происходить либо путем копирования гена VSG в сайт активного выражения, или путем транскрипционной активации ранее немого сайта выражения (обзор 1).
Хотя большая работа посвящена исследованию антигенной изменчивости T. brucei, факторы, влияющие на частоту переключения до сих пор плохо изучены. Исследования на сегодняшний день было затруднено тем , что в то время как переключение происходит стохастически в пробирке, частоты переключения очень низкие, порядка 1 в приблизительно 10 6 клеток 2. Это делает его трудно измерить ли уменьшение заданного возрастает фактор или частоту переключения, так как переключение трудно обнаружить в первую очередь. До 2009 года, методы выделения коммутаторами в данной популяции были длительными и трудоемкими. К ним относятся пассажей трипаносом через мышей, иммунизированных против доминирующего VSG, а затем сбора клетокчерез день 3, или считая сотни клеток с помощью иммунофлуоресценции 4,5. Другая стратегия зависит от отбора на устойчивость к лекарственным препаратам для выделения коммутаторами 6. Поскольку африканские трипаносомы , выращенные в пробирке , как правило , состоят из большого населения , выражающего один крупный вариант, и гораздо меньшее население коммутаторами , выражающих альтернативные варианты, мы имеем в виду основной вариант в этой статье в качестве доминирующей, начиная VSG. При этом мы ни в коей мере хотим сказать, что этот крупный вариант имеет большую пригодность по сравнению с другими вариантами в популяции.
Здесь мы опишем метод, который может надежно оценить число трипаносом, выражающую недоминирующую VSG в данной популяции в 3 – 4 ч. Этот метод особенно полезен, когда кто-то хочет, чтобы установить, увеличивает ли данное генетическое манипулирование или медикаментозное лечение количество коммутируемых клеток в популяции. Вместо того, чтобы избавить население клеток, экспрессирующих Д.О.СМОРОДИНСКИЙ, начиная VSG через наркотики или иммунологическими средствами, эти клетки уничтожаются путем первого нанесения на них магнитными гранулами, соединенными с антителом против доминирующего VSG, а затем изолировать их на магнитной колонке. Коммутируемая население затем собирают в проточные и вновь окрашивали Флуорофор меченными анти-VSG антитела для выявления загрязняющих веществ. Количественное достигается путем добавления определенного числа абсолютных счетных бус для каждого образца так , что отношение бусинок к клеткам могут быть определены и использованы для количественного определения количества коммутаторами в популяции 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Что касается экспериментальной техники, наиболее важный компонент протокола держит все образцы холодной. Трипаносомы очень быстро усваивают антитела , связанные с их поверхностью 9, но этот процесс зависит моторику, и не оказывает влияния на анализ тех пор , пока клетки выдержива…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы иметь в виду Георгиевский крест общих рекомендаций по трипаносом биологии. Эта работа также была поддержана грантом GCE Билла и Мелинды Гейтс, DS в НФС Graduate Fellowship (Research DGE-1325261) для управления записями и NIH / NIAID (грант № AI085973) в ФНП. Мы благодарим Галадриэль Hövel-Miner для использования штамма, содержащего ген и распознавания сайта I-SCEI.
Materials
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
- Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
- Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
- Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
- Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
- Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).
- Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).
- Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).
- Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).
