detektering av<em> Trypanosoma brucei</em> Variant ytglykoprotein Omkoppling av magnetkamera Aktivt cellsortering och flödescytometri

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

Den protozo parasit, Trypanosoma brucei, är en orsakande medlet av sjukdomar som drabbar människor (via Trypanosoma brucei gambiense och Trypanosoma brucei rhodesiense) och djur (via Trypanosoma brucei brucei) hela Afrika söder om Sahara. Den överförs till däggdjursvärden genom saliven av tsetseflugan vektorn. Både människor och djur afrikansk sömnsjuka orsaka en allvarlig ekonomisk börda i endemiska områden, och några läkemedel är tillgängliga eller under utveckling för behandling av antingen sjukdom. Att förstå mekanismerna för immunundan är avgörande för utveckling av läkemedel för trypanosomiasis. Antigenvariation hos den täta, variant ytglykoprotein (VSG) päls som täcker parasiten är en av de primära medel genom vilka T. brucei undviker däggdjursantikroppssvar. Ca 2000 varianter av VSG-genen existerar i trypanosom-genomet, men endast en transkriberas vid varje given tidpunkt från ett på ~ 15 expressions platser. "Omkoppling" av det uttryckta VSG kan ske antingen genom att kopiera en VSG gen i aktivt uttryck webbplats eller genom transkriptionsaktivering av en tidigare tyst uttryck webbplats (översikt i ^ett).

Även mycket arbete har lagts ner på att förstå antigenvariation i T. brucei, är de faktorer som påverkar switchfrekvensen fortfarande dåligt kända. Studier hittills har hindrats av det faktum att medan omkoppling sker stokastiskt in vitro, switchfrekvenser är mycket låga, i storleksordningen en på cirka 10 ⁶ celler ^2. Detta gör det svårt att mäta om en viss faktor ökar eller minskar switchfrekvens, eftersom omkopplings är svåra att upptäcka i första hand. Före 2009, metoder för isolering paneler i en given population var långa och arbetskrävande. Dessa inkluderade Pass trypanosomer genom möss som immuniserats mot den dominerande VSG och sedan skörda celleren dag senare ^tre, eller räkna hundratals celler genom immunofluorescens ^4,5. En annan strategi är beroende av val för läkemedelsresistens för att isolera paneler ^6. Eftersom afrikanska trypanosomer odlas in vitro är typiskt består av en stor population som uttrycker en större variant, och en mycket mindre population av switchar uttrycker alternativa varianter, hänvisar vi till den stora varianten hela detta dokument som den dominerande, börjar VSG. På så sätt har vi på något sätt vill antyda att denna stora varianten har större kondition än andra varianter i befolkningen.

Här beskriver vi en metod som på ett tillförlitligt sätt kan mäta antalet trypanosomer som uttrycker ett icke-dominanta VSG i en given population i 3-4 h. Denna metod är särskilt användbar för när man vill fastställa huruvida en given genetisk manipulation eller läkemedelsbehandling ökar antalet omkopplade celler i en population. I stället för att befria populationen av celler som uttrycker dominant start VSG genom droger eller genom immunologiska metoder, är dessa celler elimineras genom att först belägga dem med magnetiska kulor kopplade till antikroppar mot det dominerande VSG och sedan isolera dem på en magnetisk kolonn. Den omkopplade populationen uppsamlas sedan i genomflödet och färgades igen med en fluorofor märkt anti-VSG-antikropp för att identifiera kontaminanter. Kvantifiering åstadkoms genom att tillsätta ett definierat antal absoluta räknings pärlor till varje prov så att förhållandet av pärlor till celler kan bestämmas och användas för att kvantifiera antalet switchar i populationen ^7.

Protocol

OBS: Under hela förfarandet, är det nödvändigt att hålla cellerna på is. Kalla medier bör också användas i hela. 1. Prov Skörd Växa Lister 427-stammen blodomloppet trypanosomer till en densitet av 0,5 – 1 miljon / ml. Det är bäst att börja kulturer med ett litet antal parasiter. Spinn ner 50 x 10 6 celler / prov i 10 minuter vid 1500 x g. Var noga med att lämna 1 x 10 6 celler i odling under senare användas som positiva och negativa kontroller…

Representative Results

Den metod som beskrivs här användes för att visa att dubbelsträngbrott inom VSG uttryck platsen ökade antalet switchar i en population 8. Här visar vi representativa resultat från en population av trypanosomer som har liknande lockats att generera en dubbelsträngbrott vid uttryck platsen. Vi jämför dessa trypanosomer till dem som inte har förmåtts att generera en dubbelsträngbrott. Figur 1 visar representativa flödescytometri tomter från un-indu…

Discussion

När det gäller experimentell teknik, är den mest kritiska komponenten i protokollet att hålla alla prover kallt. Trypanosomer mycket snabbt internalisera antikropp bunden till deras yta ^9, men denna process är motilitet beroende och inte påverkar analysen, så länge som cellerna hålls vid 4 ° C. Alla prover bör alltid hållas på is, och pipettering bör göras snabbt för att minimera exponeringen för 25 ° C labbmiljö. Cold HMI-9 med serum bör vara tillgängliga i början av experimentet och b?…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a