Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

Summary

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Abstract

L'Institut national de ImageJ de santé est un puissant disponible gratuitement suite logicielle, de traitement d'image. ImageJ dispose d'algorithmes complets d'analyse de particules qui peuvent être utilisés efficacement pour compter diverses particules biologiques. Lorsque l'on compte un grand nombre d'échantillons de cellules, le hémocytomètre présente un goulot d'étranglement en ce qui concerne le temps. De même, le comptage des membranes à partir d'essais de migration / invasion avec le plug-in ImageJ compteur de cellules, bien que précise, est le travail exceptionnellement intensive, subjective, et infâme pour causer des douleurs au poignet. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé deux plugins au sein de ImageJ pour la seule tâche de hémocytomètre automatique (ou volume connu) et la migration / invasion cellulaire comptage. Les deux plugins reposent sur la capacité d'acquérir des micrographies de haute qualité avec un fond minimal. Ils sont faciles à utiliser et optimisé pour le comptage rapide et l'analyse des échantillons de grande taille avec des outils d'analyse intégrés pour aider à l'étalonnage des comptages. En combinant le principe de bases de compteur de cellules avec un algorithme de comptage et de post-comptage analyse automatisée, ce qui augmente considérablement la facilité avec laquelle les essais de migration peuvent être traités sans aucune perte de précision.

Introduction

Dans le comptage des cellules in vitro est une technique de base importante dans une large gamme d'expériences de culture tissulaire. Déterminer avec précision le nombre de cellules dans une culture est essentielle pour la reproductibilité expérimentale et la normalisation ^1,2. Le comptage des cellules peut être effectuée manuellement en utilisant un hémocytomètre ainsi que l' utilisation d' une variété de méthodes automatisées, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients ^3,4,5. La plupart des méthodes automatisées pour le comptage des cellules appartiennent à l'une des deux classes, ceux qui utilisent le principe de Coulter ou de cytométrie de flux. compteurs Coulter profitent de cellules résistance électrique afin de déterminer le nombre de cellules et la taille. Ils sont rapides, précis et moins coûteux que les cytomètres de flux. Cependant, ils sont rarement utilisés que pour le comptage des cellules en raison de leur coût considérable par rapport au comptage manuel ^3. Cytomètres de flux, d'autre part, sont chers, mais ils ont de nombreuses applications telles que le comptage des cellules, l'analyse de la forme des cellules, de structure et la cellule de mesure interne marqueurs de ^4,5. Les machines qui utilisent l'une de ces deux principes sont disponibles auprès de nombreux fabricants. Comptage manuel est abordable , mais beaucoup de temps et sujettes à des biais tandis que les méthodes automatisées viennent avec une fraction du temps nécessaire pour le comptage manuel , mais en utilisant des machines coûteuses ^6.

D' autres procédés de culture de cellules communes sont tests in vitro de la motilité cellulaire, à savoir, la migration cellulaire et l' invasion ^7. Migration et l'invasion des tests sont communément utilisées pour étudier la motilité cellulaire et l'invasivité en réponse à une réponse chimiotactique. En outre, ils sont largement utilisés pour étudier le développement embryonnaire, la différenciation, la réponse inflammatoire, et les métastases de plusieurs types de cellules ^7-11. Les cellules qui ont migré ou envahies à travers la membrane poreuse d'un test de migration peuvent être quantifiés de deux façons différentes. En premier lieu, par coloration des cellules avec un colorant fluorescent, de la dissociation from la membrane et la quantification en utilisant un lecteur de fluorescence ^12. Une limitation de cette méthode de quantification est qu'aucun enregistrement peut être retenu des membranes et il n'y a aucune possibilité pour une analyse ultérieure ^13. La deuxième méthode de quantification est pour la migration / cellules à fixées et colorées par un colorant fluorescent ou plus communément, avec des colorants cytologiques tels que le cristal violet, toluidine colorant bleu ou hématoxyline envahi; puis les cellules sont quantifiées manuellement à l' aide des images microscopiques inversées de ces membranes qui est une tâche de longue haleine très ^12,13.

Pour pallier les inconvénients de comptage manuel des cellules, deux marqueurs fiables et précises cellules automatisées pour la concentration des cellules et pour l'essai de migration ont été développés. Ces contre algorithmes cellulaires automatisés ont été développés pour ImageJ comme un plugin Java en utilisant l'ordinateur de la langue d'Oracle. ImageJ est un outil de traitement d'image publique et largement utilisé développé par l'Institut national de Heanté (NIH) ^14,15; ainsi, l'écriture de ces plugins pour ImageJ facilite l'intégration dans la communauté biologique.

L'automatisation de comptage de cellules assure un débit élevé et la reproductibilité par rapport à un comptage manuel. Bien que d' autres logiciels et plugins disponibles peuvent être utilisées pour calculer la concentration de cellules par analyse d'image ^5,16,17, Concentration cellulaire Calculatrice plug – in est rapide et peut également gérer des dilutions de cellules et de traitements. En outre, tous les résultats et les calculs de ces deux compteurs peuvent être enregistrés et exportés. Les deux plugins décrits dans le présent document sont optimisés pour l'utilisation d'un microscope à contraste de phase pour l'imagerie des cellules vivantes et un grand champ de vision (ensemble de capture de la membrane) imagerie pour les membranes d'essai de migration à travers l'utilisation d'un champ de dissection. Les plugins sont disponibles gratuitement en téléchargement avec des instructions d'installation à partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

Microscope 1. Composé et configuration de la caméra (Calculatrice de concentration cellulaire) Augmenter ampoule luminosité complète avec le bouton de réglage de la lumière, passer à l'objectif 4X, et assurer les filtres de contraste de phase sont sélectionnés. NOTE: Tout inversé microscope à contraste de phase pour la culture de tissus avec un fond sombre, par exemple, PhP contraste de phase, peuvent être utilisés suivant les procédures de microscope et de la caméra standar…

Representative Results

Calculatrice cellule de concentration La figure 1 présente le processus global de la CCC étalonnage et l' acquisition d'images dénombrable. Figure 1A et 1B représentent l'image d'étalonnage P-carré et le calcul de P-carré en pixels. La CCC détermine la concentration des cellules dans un volume donné par la formule: <img alt="L&…

Discussion

Les étapes critiques, le dépannage et Limitations

La nature même des méthodes de calcul automatiques, en particulier celles de l'analyse des particules, nécessite la capacité mathématique pour définir ces particules. Par conséquent, la précision de la fois Calculatrice cellule de concentration et de détermination de la migration compteur est majorly dépend fidélité d'image, qui est, à quel point l'image capturée ressemble à la membrane échantillon de cellules ou de…

Materials

HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA  1X PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 – 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides – Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293,
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth – 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2   2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required