स्वचालित मात्रा का ठहराव और सेल गिनती प्रक्रिया ImageJ plugins का उपयोग का विश्लेषण
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
स्वास्थ्य के ImageJ के राष्ट्रीय संस्थान एक शक्तिशाली, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर सुइट है। ImageJ व्यापक कण विश्लेषण एल्गोरिदम जो प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता विभिन्न जैविक कणों गिनती करने के लिए है। जब सेल के नमूने की बड़ी संख्या की गिनती, hemocytometer समय के लिए संबंध के साथ एक टोंटी प्रस्तुत करता है। इसी तरह, ImageJ प्लगइन सेल काउंटर के साथ पलायन / आक्रमण assays से झिल्ली की गिनती है, हालांकि सही, असाधारण श्रम, गहन व्यक्तिपरक, और कलाई में दर्द पैदा करने के लिए कुख्यात है। इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम स्वचालित hemocytometer (या ज्ञात मात्रा) और पलायन / आक्रमण सेल गिनती का एकमात्र कार्य के लिए ImageJ भीतर दो plugins विकसित की है। दोनों plugins कम से कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च गुणवत्ता micrographs हासिल करने की क्षमता पर निर्भर हैं। वे का उपयोग करने के लिए आसान और त्वरित गिनती और निर्मित में विश्लेषण उपकरणों के साथ बड़ा नमूना आकार के विश्लेषण में गिना जाता है की जांच में मदद करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। मूल सिद्धांत के संयोजन सेएक स्वचालित मतगणना एल्गोरिथ्म और बाद मतगणना विश्लेषण के साथ सेल काउंटर की है, यह बहुत आसानी के साथ जो पलायन assays सटीकता के किसी भी हानि के बिना संसाधित किया जा सकता बढ़ जाती है।
Introduction
इन विट्रो सेल की गिनती में टिशू कल्चर प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक महत्वपूर्ण बुनियादी तकनीक है। सही रूप में एक संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण प्रयोगात्मक reproducibility और मानकीकरण 1,2 के लिए आवश्यक है। सेल गिनती एक hemocytometer का उपयोग के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित तरीकों की एक किस्म है, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान 3,4,5 के साथ प्रत्येक का उपयोग कर मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है। सेल गिनती के लिए स्वचालित तरीकों में से अधिकांश दो वर्गों, उन है कि कल्टर सिद्धांत का उपयोग करें या प्रवाह cytometry में से एक हैं। कल्टर काउंटर सेल संख्या और आकार निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं विद्युत प्रतिरोध का लाभ ले। वे तेजी से, सही और प्रवाह cytometers की तुलना में सस्ता है। हालांकि, वे शायद ही कभी केवल सेल गिनती के लिए उनकी काफी लागत के कारण मैनुअल गिनती 3 की तुलना में उपयोग किया जाता है। cytometers प्रवाह, दूसरे हाथ पर, महंगे हैं, लेकिन वे इस तरह के सेल गिनती, कोशिकाओं के आकार, सेंट के विश्लेषण के रूप में कई आवेदन किया हैructure और आंतरिक सेल मापने 4,5 मार्करों। मशीनें कि इन दोनों सिद्धांतों का भी उपयोग कई निर्माताओं से उपलब्ध हैं। मैनुअल गिनती सस्ती लेकिन समय लेने वाली और पूर्वाग्रह के अधीन है, जबकि स्वचालित तरीके समय मैनुअल गिनती के लिए आवश्यक का एक अंश के साथ आते हैं, लेकिन महंगी मशीनों 6 का उपयोग कर।
अन्य आम सेल संस्कृति प्रक्रियाओं इन विट्रो सेल गतिशीलता assays, अर्थात्, सेल प्रवास और आक्रमण 7 में हैं। प्रवास और आक्रमण assays सामान्यतः एक कीमोटैक्टिक प्रतिक्रिया के जवाब में सेल गतिशीलता और invasiveness जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, वे व्यापक रूप से भ्रूण विकास, भेदभाव, भड़काऊ प्रतिक्रिया, और मेटास्टेसिस अनेक प्रकार की कोशिकाओं 7-11 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। कोशिकाओं है कि पलायन या एक प्रवास परख के झरझरा झिल्ली के माध्यम से आक्रमण किया है दो अलग अलग तरीकों में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। सबसे पहले, एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ कोशिकाओं को धुंधला हो जाना, हदबंदी से इधर-उधरझिल्ली, और मात्रा का ठहराव एक फ्लोरोसेंट पाठक 12 का उपयोग कर रहा हूँ। मात्रा का ठहराव की इस पद्धति की एक सीमा है कि कोई रिकॉर्ड झिल्ली के बनाए रखा जा सकता है और वहाँ आगे के विश्लेषण के लिए 13 कोई संभावना नहीं है। दूसरी मात्रा का ठहराव विधि चले गए पर / हमला किया जाता है तय की और फ्लोरोसेंट रंजक या अधिक सामान्यतः, ऐसे क्रिस्टल बैंगनी, toluidine नीले रंग की डाई या hematoxylin के रूप में कोशिकाविज्ञान रंगों के साथ साथ दाग किया जा कोशिकाओं; फिर कोशिकाओं स्वयं इन झिल्ली जो एक बहुत समय लेने वाला काम है 12,13 की औंधा सूक्ष्म छवियों का उपयोग मात्रा रहे हैं।
मैनुअल सेल गिनती की खामियों को दूर करने के लिए, दो विश्वसनीय और सटीक सेल एकाग्रता के लिए और प्रवास परख के लिए स्वचालित सेल काउंटर विकसित किए गए। ये स्वचालित सेल काउंटर एल्गोरिदम एक प्लगइन ओरेकल के जावा कंप्यूटर भाषा का प्रयोग के रूप में ImageJ के लिए विकसित किए गए। ImageJ एक सार्वजनिक और व्यापक रूप से इस्तेमाल छवि प्रसंस्करण Hea के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा विकसित उपकरण हैLTH (एनआईएच) 14,15; इस प्रकार, ImageJ के लिए इन plugins लेखन जैविक समुदाय में आसानी से एकीकरण की सुविधा।
सेल गिनती के स्वचालन मैनुअल गिनती की तुलना में उच्च throughput और reproducibility सुनिश्चित करता है। हालांकि अन्य उपलब्ध सॉफ्टवेयर और plugins छवि विश्लेषण 5,16,17, सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर प्लगइन के माध्यम से सेल एकाग्रता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से और भी कोशिकाओं और उपचार के dilutions संभाल सकते हैं। इसके अलावा, इन दो काउंटरों से सभी परिणाम और गणना बचाया और निर्यात किया जा सकता है। इस पत्र में वर्णित दो plugins एक विदारक गुंजाइश के उपयोग के माध्यम से लाइव सेल इमेजिंग और देखने के बड़े क्षेत्र (पूरे झिल्ली पर कब्जा) प्रवास परख झिल्ली के लिए इमेजिंग के लिए एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: plugins से स्थापना के निर्देश के साथ डाउनलोड के लिए आसानी से उपलब्ध हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
गंभीर कदम, समस्या निवारण, और सीमाएं
स्वचालित कम्प्यूटेशनल विधियों के स्वभाव, विशेष कण विश्लेषण के उन लोगों के, इन कणों को परिभाषित करने के लिए गणितीय क्षमता जरूरी है। नतीजतन, दोनों सेल एकाग्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
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