Автоматизированная Количественное и анализ процедур Cell подсчет с использованием ImageJ плагинов
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
Национальный институт здравоохранения ImageJ является мощным, свободно доступны для обработки изображений пакет программного обеспечения. ImageJ имеет алгоритмы анализа частиц комплексные, которые могут быть эффективно использованы для подсчета различных биологических частиц. При подсчете большого числа образцов клеток, гемоцитометре представляет собой узкое место в отношении времени. Точно так же, подсчитывая мембраны от миграции / инвазии анализов с Счетчик клеток ImageJ плагин, хотя точные, исключительно трудоемкий, субъективная, и печально известный за причинение боли запястья. Для удовлетворения этой потребности, мы разработали два плагина в пределах ImageJ для единственной задачей автоматизированной гемоцитометра (или известного объема) и подсчета миграции / инвазии клеток. Оба плагина полагаться на способность приобретать высококачественные микрофотографии с минимальным фоном. Они просты в использовании и оптимизирован для быстрого подсчета и анализа больших размеров образцов со встроенными инструментами анализа, чтобы помочь калибровки графов. Объединив основной принципе годы Счетчик клеток с автоматизированной алгоритма подсчета и после подсчета анализа, это значительно увеличивает легкость, с которой миграционные анализы могут быть обработаны без потери точности.
Introduction
В пробирке подсчета клеток является важным основным методом в широком диапазоне экспериментов для культур тканей. Точного определения количества клеток в культуре , имеет важное значение для экспериментальной воспроизводимости и стандартизации в 1,2 раза . Подсчета клеток можно осуществить вручную с помощью гемоцитометра, а также с использованием различных автоматизированных методов, каждый со своими преимуществами и недостатками 3,4,5. Большинство автоматизированных методов подсчета клеток принадлежат к одному из двух классов, те, которые используют принцип Coulter или проточной цитометрии. счетчики Coulter воспользоваться клеток электрического сопротивления, чтобы определить количество и размер ячейки. Они быстрые, точные и дешевле, чем цитометров. Тем не менее, они редко используются только для подсчета клеток из – за их значительной стоимости по сравнению с ручным подсчетом 3. Поток цитометры, с другой стороны, являются дорогими, но они имеют много приложений, таких как подсчет клеток, анализ формы клеток, стructure и измерения внутренней ячейки маркеров 4,5. Машины, которые используют любой из этих двух принципов доступны от многих производителей. Ручной подсчет является доступным , но отнимает много времени и при условии смещения в то время как автоматизированные методы приходят с фракцией времени , необходимого для ручного подсчета , но с использованием дорогих машин 6.
Другие процедуры общей культивирования клеток в пробирке клеток моторики анализов, а именно, миграции клеток и вторжения 7. Миграция и инвазия анализы обычно используются для изучения подвижности клеток и инвазивности в ответ на хемотаксисного ответа. Кроме того, они широко используются для изучения эмбрионального развития, дифференцировки, воспалительную реакцию, и метастазирование нескольких типов клеток 7-11. Клетки, которые мигрировали или захватившие через пористую мембрану анализа миграции может быть определена количественно двумя различными способами. Во-первых, путем окрашивания клеток с флуоресцентным красителем, диссоциации сюдам мембрану, и количественно оценить с помощью флуоресцентного читателя 12. Ограничение этого метода количественного определения является то , что запись не может быть сохранена мембран и нет никакой возможности для дальнейшего анализа 13. Второй метод Количественное для мигрировали / захвачена клетки, которые будут фиксировали и окрашивали с флуоресцентным красителем или, чаще всего, с цитологическим красители, такие как кристаллический фиолетовый, толуидиновым синим красителем или гематоксилином; Затем клетки количественно вручную , используя перевернутые микроскопические изображения этих мембран , что является очень трудоемкой задачей 12,13.
Для того, чтобы преодолеть недостатки подсчета клеток вручную, были разработаны два надежных и точных автоматизированных счетчиков клеток для концентрации клеток и для анализа миграции. Эти автоматизированные алгоритмы счетчика клеток были разработаны для ImageJ как плагин с использованием языка программирования Java от Oracle. ImageJ является публичным и широко используемым инструментом для обработки изображений, разработанная Национальным институтом HeaLtH (NIH) 14,15; Таким образом, записывая эти плагины для ImageJ облегчает интеграцию в биологическом сообществе.
Автоматизация подсчета клеток обеспечивает высокую пропускную способность и воспроизводимость по сравнению с ручным подсчетом. Хотя другие доступное программное обеспечение и плагины могут быть использованы для расчета концентрации клеток на основе анализа изображений 5,16,17, Cell концентрационного Calculator плагин очень быстро и может также обрабатывать разведений клеток и лечения. Кроме того, все результаты и расчеты из этих двух счетчиков могут быть сохранены и экспортированы. Эти два плагина, описанные в этой статье, оптимизированы для использования контрастного микроскопа фазы для клеток живого изображения и большим полем зрения (полный цикл захвата мембраны) изображений для анализа миграции мембран за счет использования в рамках рассекает. Плагины свободно доступны для загрузки с инструкциями по установке от: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги, устранение неполадок и ограничения
Сама природа автоматизированных вычислительных методов, в частности, те из анализа частиц, требует математические способности определять эти частицы. Следовательно, точность обеих клеточных концентрационного Кальк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
