Flow cytometri af partikelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at kvantificere allergen-loaded partikler ved flowcytometri. Partikler i luften partikler kan virke som bærere af adsorberede allergener. Vi viser her, at flowcytometri, en fremgangsmåde almindeligt anvendt til at karakterisere suspenderede stoffer> 0,5 um i diameter, kan anvendes til at måle disse allergen-loaded partikler.

Abstract

Flowcytometri er en fremgangsmåde almindeligt anvendt til at kvantificere suspenderede faste stoffer, såsom celler eller bakterier i et størrelsesområde fra 0,5 til tocifrede mikrometer i diameter. Foruden en karakterisering af fremadgående og sidelæns scatter egenskaber, det muliggør anvendelse af fluorescerende mærkede markører som antistoffer til påvisning respektive strukturer. Ved indirekte antistof-farvning, flowcytometri anvendes her for at kvantificere birkepollenallergen (præcist Bet v 1) -loaded partikler på 0,5 til 10 um i diameter i inhalerbar partikler (PM10, partikelstørrelse ≤10 um i diameter). PM10 partikler kan virke som bærere af adsorberede allergener eventuelt transportere dem til de nedre luftveje, hvor de kunne udløse allergiske reaktioner.

Hidtil indholdet af PM10 allergen er blevet undersøgt ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assays (ELISA'er) og scanningselektronmikroskopi. ELISA måler opløst, og ikke partiklen-bundet allergen. Sammenlignet med scanning elektronmikroskopi, som kan visualisere allergen-loaded partikler, flowcytometri kan yderligere kvantificere dem. Som allergen indhold af omgivende luft kan afvige fra birkepollen tæller, kan allergiske symptomer måske korrelere bedre med allergen eksponering end med pollen tæller. I forbindelse med kliniske data, den præsenterede metode giver mulighed for at teste i fremtidige eksperimenter, om allergiske reaktioner over for birkepollen-antigener er forbundet med Bet v 1 allergen indhold i PM10-partikler> 0,5 um.

Introduction

Luftforurening er at blive betragtet som en vigtig miljømæssig årsag til den øgede forekomst og sværhedsgrad af luftvejsallergi observeret i de seneste årtier ^1-3. Desuden var der en stigende interesse for fordelingen af almindelige allergener i støv ^4,5.

Birkepollen kan provokere høfeber, men kan også være en vigtig udløser af allergisk astma ^6-8. Hele birkepollen er ikke sandsynligt at indtaste de nedre luftveje eller findes i PM10 som følge af sin størrelse (22 um i diameter). Dog kan birkepollenallergener som Bet v 1, de store birkepollenallergen komponent, frigives efter pollen ruptur ⁹ og kan binde til omgivende luft partikler ^10, hvilket muligvis indtaste de nedre respiratoriske luftveje. Faktisk er det blevet vist, at PM10 kan indeholde biologisk aktive allergener som påvist ved in vitro-aktivering af basophiles fra et pollen allergisk proband ¹¹ </sup>.

Bet v 1 allergen indhold i PM10 prøver er blevet undersøgt ved at ekstrahere den respektive allergen og efterfølgende kvantificering med ELISA ^12-14. Med ELISA-teknikken, blev det opløste allergen målt, men mængden af ​​allergen-loaded partikler var stadig ukendt. Scanning elektronmikroskopi afslørede allergen-loaded partikler, men tillod ikke kvantificering ^10,15.

Denne undersøgelse beskæftiger flowcytometri at kvantificere andelen af ​​Bet v 1-loaded PM10-partikler i luftprøver omgivende. På grund af detektionsgrænsen for flowcytometeret kun partikler kan undersøges større end 0,5 um. Den> 0,5 um brøkdel af PM10 vil blive yderligere omtalt som _{PM10> 0.5.}

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol beskriver indirekte farvning af PM10 partikler med et monoklonalt antistof (monoklonalt muse IgG1-antistof, klon MA-3B4) mod Bet v 1, de store birkepollen antigen komponent, plus et allophycocyanin (APC) -mærkede sekundært antistof (anti -Mouse IgG1-antistof, klon A85-1) og den efterfølgende analyse på et flowcytometer. Med passende andre antistoffer til rådighed, kan denne metode udvides til påvisning af andre antigener bundet til omgivende luft partikler. 1. PM10 Sampling Indsamle PM10 fra luften på polytetrafluorethylen (PTFE) filtre ved anvendelse af en lav volumen sampler med en strømningshastighed på 2,3 m 3 / time (figur 1). En karakterisering af prøvetageren anvendes til eksperimenterne beskrevet her er fundet i 16. Driftstid afhænger af mængden af ​​PM10 nødvendigt (normalt mellem 1 og 10 dage). Ved slutningen af ​​inkubationstiden fjerne filteret fra sampler og fryse den på-20 ° C indtil anvendelse. Figur 1. Lav volumen PM10 sampler. Eksempel på lav lydstyrke PM10 sampler. Klik her for at se en større version af dette tal. 2. PM10 Fjernelse og Particle Count Lad PTFE filter tø i ca. 5 min. Derefter satte filteret i en ren polystyrol petriskål (figur 2A). Tag en ny petriskål for hvert filter, hvis mere end ét filter er behandlet. Efterfølgende overlejre PTFE filter med phosphatbufret saltvand (PBS). Denne protokol er fastlagt for en endelig PM10 koncentration på 8×10 6 partikler per ml (se trin 3.3). For at opnå mindst den koncentration, bruge følgende empiriske volumen PBS at overlejre filteret med: Hvis PM10 kollektion tid var < 2 dage, bruge 2 ml. For inkubationstider ≥ 2 dage, bruge 4 ml. BEMÆRK: For at øge koncentrationen af ​​PM10 suspension partikel, kan suspensioner fra forskellige filtre samles, hvis dette er hensigtsmæssigt. Hold PTFE filter med pincet og børste med en elektrisk tandbørste med en følsom børstehoved i 1 min (figur 2B, 2C). Overfør partikel-PBS-suspension, herefter benævnt PM10 suspension, til et rent reagensglas. Figur 2. PM10 fjernelse med en elektrisk tandbørste. En polytetrafluorethylen filter med stikprøven PM10 anbringes i en polystyrol petriskål (A) og overlejres med 4 ml PBS. Derefter PM10 fjernes med en elektrisk tandbørste (B: før børstning og C: efter tandbørstning i 1 minut).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal. Måle koncentrationen af PM10-partikler, fx ved anvendelse af en partikeltæller. Fortynd en tilstrækkelig mængde af PM10 suspension såsom 50 pi i 10 ml isotonisk måling buffer, måler tre gange og beregne gennemsnitlige totale antal partikler per ml. Sørg for at bruge en partikel tæller, som kan detektere partikler af den relevante størrelse. 3. Bet v 1-farvning Beregne antallet af reaktionsrør, der kræves til analyse af prøven: Mindst tre er behov reaktionsrør: (i) ét rør med kun prøve (native kontrol) (ii) ét rør med prøve plus sekundært antistof (negativ kontrol), og ( iii) et rør med prøven plus primær og sekundær antistof (specifik prøve). Hvis målt for første gang fremstilles mindst to reaktionsrør til (i) (ii),og (iii) at have nok materiale til korrekt justering cytometer indstillinger (se trin 4.1). Beregne mængden af ​​PM10 suspension kræves for antallet af reaktionsrør. Hvert reaktionsrør kræver 50 pi suspension. Juster partikelkoncentrationen målt i trin 2.4 til volumenet af suspensionen beregnet i trin 3.2 til en slutkoncentration på 8×10 6 partikler per ml ved tilsætning af en passende mængde PBS. BEMÆRK: Den resterende PM10 suspension kan fryses ved -20 ° C til fremtidige eksperimenter, selvom frisk anbefales forberedt PM10 suspension til denne protokol. Blok uspecifik binding ved at supplere PM10 suspensionen med bovint serumalbumin (BSA) i en slutkoncentration på 0,02%, under anvendelse af en stamopløsning, såsom 1% BSA fremstillet med PBS. Vortex kortvarigt og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. For hver prøve, der skal analyseres ved flowcytometri, overføre 50 pi af suspensionen fra trin 3.4 til aclean reaktionsglas. Tilføj et monoklonalt muse-antistof mod Bet v 1 i en slutkoncentration på 0,02 pg / pl til reaktionsrørene udpeget til specifik farvning, vortex kortvarigt og inkuberes i 60 minutter ved stuetemperatur. Lad reaktionsrørene med PM10-BSA suspension udpeget til det native kontrol og den negative kontrol også ophold i 60 minutter ved stuetemperatur. Vask alle prøver ved at tilsætte 500 pi PBS suppleret med 0,02% BSA til hvert reaktionsrør, vortex kortvarigt og centrifugeres prøverne efterfølgende til 4.700 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres omhyggeligt ved anvendelse af en vakuumpumpe. Gentag trin 3.6. Bestemme den samlede mængde af APC-mærket sekundært anti-mus IgG1-antistof nødvendig: 1 ug antistof opløst i 50 pi PBS suppleret med 0,02% BSA pr reaktionsglas. Fortynd den passende mængde antistof med den respektive volumen PBS suppleret med 0,02% BSA. Der tilsættes 50 pi fortyndet sekundært antistof til alle reaktionsrørene bortset reaktionsrøret udpeget til det native kontrol. Supplere sidstnævnte med 50 pi PBS suppleret med 0,02% BSA. Vortex alle prøver i et par sekunder. Inkuber alle prøver i 30 minutter i mørke. Gentag trin 3.6 to gange. Der tilsættes 50 pi PBS til hvert reaktionsrør, vortex og analysere prøverne på et flowcytometer. 4. flowcytometrisk analyse Brug af det native kontrol, justere følgende cytometret parametre til at optimere dataanalyse. Ved at bruge forward scatter (FSC) tærskel controller vises på enheden styrekort, sætte tærsklen FSC til den laveste værdi (200) og starte analysen. Ved at bruge scatter spænding controller, justere FSC og sidelæns scatter (SSC) på den måde, der kan påvises alle PM10-partikler, og at befolkningen af ​​partikler ligger omtrent i the midten af ​​FSC-aksen og i den nederste halvdel af SSC-aksen. Ved anvendelse af fluorescens spændingsregulator, justere APC spænding og en anden fluorescens spænding som fluoresceinisothiocyanat (FITC), hvilket ikke udsender på samme bølgelængde som APC, om nødvendigt. Sørg for, at alle partikler er synlige i den nederste halvdel af begge fluorescens akser. Fortløbende, undersøge hver prøve, herunder de indfødte kontrol og gemme FSC, SSC, APC, og FITC-data på mindst 10.000 partikler pr prøve. Evaluere data med den respektive software. Adsorberede allergener indhold i den konkrete prøve kan kvantificeres på to måder: Analyser APC fluorescensintensitet af alle partikler (median værdi) som et mål for Bet v 1 belastning frem for alle PM10-partikler. BEMÆRK: Hvis den specifikke prøve indeholdt allergen, bør APC fluorescensintensitet stige i den specifikke prøve sammenlignet med den negative kontrol. I modsætning hertil er andre fluorescence intensiteter (f.eks., FITC fluorescens intensitet) bør ikke ændres væsentligt. Beregn procentdelen af ​​PM10-partikler med bundet anti-Bet v 1-antistof. Derved i den negative kontrol, sætte en port omkring partiklerne betragtes APC positiv, kopiere og indsætte denne port i den konkrete prøve og trække procentdelen af ​​APC positive partikler i den negative kontrol fra procentdelen af ​​APC positive partikler i den konkrete prøve.

Representative Results

Bet v 1 allergen adsorption til PM10> 0,5 partikler blev kvantificeret ved indirekte antistof-farvning og efterfølgende analyse på et flowcytometer. En PM10 prøve fra høj pollensæson tjente som skabelon. Som anført i trin 3.1, den negative kontrol bestod af PM10-partikler inkuberet med APC mærket sekundært antistof kun (figur 3A). PM10-partikler farvet med anti-Bet v 1-antistof plus sekundært antistof viste de allergen lastet partikler (figur 3B). Som beskrevet i trin 4.3, blev to måder at kvantificere allergen belastning, der anvendes: På den ene side blev medianværdien af ​​APC fluorescensintensitet af alle partikler analyseres være 137 for den negative kontrol og 904 for den specifikke prøve. På den anden side blev den procentdel af partikler med bundet anti-Bet v 1-antistof bestemmes: En port blev sat omkring APC positive partikler i den negative kontrol og efterfølgende copied og indsættes i den særlige prøve. I den negative kontrol, blev 3% af PM10> 0,5 partikler anses APC positiv. Denne procentdel af falske positive partikler blev fratrukket procentdelen af positive partikler i den specifikke prøve således resulterer i 77,5% APC positive PM10> 0,5 partikler i den specifikke prøve. For at bevise, at den observerede binding af anti-Bet v 1 antistof var specifik, blev bindingskapacitet blokeret med det tilsvarende antigen før farvning. Dette formindsket binding af anti-Bet v 1-antistof med 69%, hvis kvantificeret ved APC fluorescensintensitet, og med 84%, hvis kvantificeret ved procentdelen af Bet v 1 positiv PM10> 0,5 partikler (figur 3C). Figur 3. partikelbundne Bet v 1 allergenet kan visualiseres ved flowcytometri. APC fluorescensintensitet af en PM10 prøve fra høj pollen sæson kun farves med APC mærket sekundært antistof (A), farvet med anti-Bet v 1 primære antistof og efterfølgende med APC mærket sekundært antistof (B), og efter blokering det primære antistof med rekombinant Bet v 1 antigen (C ). Porten P APC + blev sat omkring partiklerne anses APC positive (vist med rødt) og respektive procentdele er angivet. Dette tal er blevet ændret en smule fra 11. Klik her for at se en større version af dette tal. For at teste, om der kan vedtages denne metode til at afsløre forskelle i mængden af adsorberet Bet v 1 indholdet af PM10> 0,5 prøver fra høj og fra lav pollensæson blev 13 PM10 prøver fra høj og 6 PM10 prøver fra lav pollensæson analyseret. Figur 4viser betydelige forskelle i APC fluorescens intensitet og i andelen af Bet v 1 positiv PM10> 0,5 partikler af PM10 prøver fra høj pollen sæsonen i forhold til PM10 prøver fra lav pollensæson. Begge kvantificeringsmetoder viste hermed lignende resultater. Figur 4. PM10 prøver fra lav og høj pollen sæsonen er forskellige i deres mængde adsorberet Bet v 1. Lav pollensæson PM10 blev udtaget i efteråret / vinteren 2013 (n = 6), høj pollensæsonen PM10 i maj 2012 og 2013 (n = 13). (A) APC fluorescensintensitet af PM10> 0,5 partikler fra høj pollen sæsonen var signifikant højere end fra lav pollen sæson (median / min / max høj pollen sæsonen: 796/313/1097; median / min / max lav pollensæson: 197 / 85/277). (B) PM10 fra high pollensæson indeholdt significantly mere Bet v 1-positive PM10> 0,5 partikler end PM10 fra lav pollen sæson (median / min / max høj pollen sæsonen: 45,2 / 18,5 / 74,5; median / min / max lav pollensæson: 11,8 / 4,4 / 19,8). Box plots viser medianværdier (indre linje af boksen), 25. og 75. percentiler henholdsvis (nedre og øvre grænser af kassen) og minimum og maksimum værdier (whiskers). *** P <0,001 versus lav pollensæson, Mann Whitney U test. Dette tal er blevet ændret en smule fra 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Et kritisk trin i protokollen er anvendelsen af ​​et passende filter til opsamling af PM10 partikler fra luften (se trin 1.1). Filteret skal være stærk nok til at udholde børstning med en elektrisk tandbørste, og ikke alle filtermaterialer opfylder dette krav. Farvningen protokol blev etableret med en PM10 partikel koncentration på 8×10 ⁶ partikler per ml. Men hvis materialet er begrænset, og pooling af prøver ikke er hensigtsmæssig, vil metoden formentlig fungere så godt, men de antistof koncentrationer (se trin 3.5 og 3.8) måske skal justeres.

Bet v 1-farvning af PM10-partikler resulterede ikke i distinkte populationer af positivt og negativt farvede partikler. Dette kan være forårsaget af de varierende mængder af Bet v 1 allergenet adsorberet til hver af partiklerne i området fra meget lidt op til en høj mængde. Dette kan resultere i en udvidelse af APC-signalet dermed flytte befolkningen modAPC positivitet. Da det er vanskeligt at adskille de positive fra negative partikler blev to kvantificeringsmetoder anvendes til at bestemme forskellene i Bet v 1-indhold af _{PM10> 0,5} enheder: (i) i forhold kvantificering ved måling af median APC fluorescensintensitet af alle partikler og (ii) fastsættelse af, APC positive partikler. Med hensyn til Bet v 1 belastning af partikler fra lav og høj pollensæson _{PM10> 0,5,} begge metoder afslørede tilsvarende resultater. Alligevel er relativ kvantificering af median fluorescensintensitet af alle partikler anbefales, da det er uafhængigt af at placere porten og dermed sandsynligvis mindre fejlbehæftet.

Til dato mange undersøgelser undersøger allergen indhold i luften partikler ved at udtrække de respektive allergen og efterfølgende kvantificering med ELISA ^5,12-14,17. Der er en grundlæggende forskel mellem den her beskrevne procedure og quantification med ELISA: ELISA kvantificerer ekstraheret og opløst antigen, mens flowcytometri analyserer partikel-bundne antigen. Ved hjælp af ELISA Bet v 1 belastning af de testede PM10 prøver (n = 8) var under detektionsgrænsen på 1,2 ng / ml (data ikke vist). Tilsvarende Buters og andre identificerede ingen Bet v 1 i PM <2,5 um fraktion og kun omkring 7% i 10 um> PM> 2,5 um fraktion, men mere end 93% i PM> 10 um brøkdel af den omgivende luft ^13. De modstridende resultater af ELISA på den ene side og FACS-analyse på den anden side, kan være forårsaget af forskelle i påvisningsmetoden sammenholdt med divergerende følsomhed. Yderligere forskning er dog nødvendig for at forstå denne forskel.

Fremgangsmåde til at visualisere partikelbundet antigen scanningelektronmikroskopi ^10,14. Ved scanningselektronmikroskopi, Ormstad et al. Visualiseret Bet v 1 på overfladen af suspenderet partikulært matr sodpartikler samplet i den høje pollen sæsonen og i mindre grad på partikler stikprøven i den lave pollen sæson ^15. Derudover blev fundet allergener fra pollen, latex og også p-glucaner skal adsorberes til forbrændingspartikler i luften ^10. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke tillader kvantificering af partikelbundet allergen.

Ved anvendelse af flowcytometri, kunne partikelbundet Bet v 1 allergen kvantificeres. Således flowcytometri kan tilbyde en ny måde at karakterisere de 10 til 0,5 um biologisk brøkdel af PM10 som med andre egnede antistoffer på hånden, kan denne metode udvides til påvisning af andre antigener af den omgivende luft partikler, fx mug, støv mide allergener eller LPS. Som PM10-partikler adsorberer ikke kun biologisk materiale, men også kemikalier og metaller ganske nemt, uspecifik binding af antistoffer kunne dog udgøre et problem. Hvis en ny antistof testes, et afgørende skridt er at bevise specifik bindeIng. Dette kan gøres ved for eksempel at blokere bindingskapacitet det specifikke antistof med det tilsvarende antigen før farvning ^11.

Som Bet v 1 indhold af omgivende luft kan variere fra birkepollen tæller ^12,13,18, kan allergiske symptomer måske korrelere bedre med allergen niveau end med pollen tæller ^14,18. Derfor er præsenteret metode i forbindelse med klinisk data gør det muligt i fremtidige eksperimenter for at undersøge, om allergiske reaktioner til Birch svarer til Bet v 1 allergen belastning af _{PM10> 0,5.}

Materials

Teflon filter	Pall Life Sciences, USA	R2PL047	47 mm, 1.0 µm
low volume sampler	Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany	LVS3	air flow of 2.3 m3/h
Phosphate-buffered saline	Biochrom, Germany	L1825	without Ca/Mg, low endotoxin
electrical toothbrush	Braun, Germany	Oral-B Vitality Sensitive
Casy cell counter	Schärfe System GmbH, Germany	Model TTC	range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm
FACSCanto II	Becton Dickinson, USA	3-laser, 8-color (4-2-2)
FACS Diva Software v6.1.3	Becton Dickinson
bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G
monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1	Indoor Biotechnologies, UK	MA-3B4	clone MA-3B4
APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody	Becton Dickinson	560089	clone A85-1
SPSSTM software version 18	PASW Statistics 18, Hongkong, China
Petri Dish	Gosselin, France	BP50-02	D 55mm, H 15mm
FACS Tube	Becton Dickinson, USA	REF 352054	5ml Polystyrene
CASYton	Roche Germany	REF 05651808001
Matrix Blank Tubes	Thermo Scientific, USA	4140	1,4 ml, PP
Centrifuge	Heraeus, Thermo Scientific	Megafuge 40R
Vacuum Pump	INTEGRA Biosciences AG, Switzerland	Model 158 320	Inetrgra Vacusafe
recombinant Bet v 1a antigen	Indoor Biotechnologies, UK	LTR-BV1A-1	Concentration:  2.0 mg/ml