जल का उपयोग करने में अंतःस्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध<em> इन विट्रो</em> Transactivation bioassays
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
इन विट्रो transactivation bioassays में पानी की गुणवत्ता की निगरानी के औजार के रूप में वादा दिखाया है, लेकिन उनकी गोद लेने और बड़े पैमाने पर आवेदन मानकीकृत तरीके और मजबूत, उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रौद्योगिकी की उपलब्धता की कमी के कारण आंशिक रूप से बाधा कर दिया गया है। इस अध्ययन में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, विभाजन गिरफ्तार सेल लाइनों मात्रात्मक पर्यावरण की गुणवत्ता पेशेवरों के लिए ब्याज की पानी के नमूने में मौजूद रसायनों के अंत: स्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए कार्यरत थे। एक एकल, मानकीकृत प्रोटोकॉल है कि व्यापक गुणवत्ता आश्वासन / गुणवत्ता नियंत्रण शामिल (क्यूए / क्यूसी) चेक (ईआर और जीआर क्रमशः) एस्ट्रोजेन और glucocorticoid रिसेप्टर गतिविधि के लिए विकसित किया गया था एक सेल आधारित प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) परख का उपयोग। कैलिफोर्निया (यूएसए) में इलाज नगरपालिका अपशिष्ट जल प्रवाह और सिस्टम मीठे पानी से सतह के पानी के नमूने, ठोस चरण निकासी का उपयोग कर निकाला और मानकीकृत आद्य का उपयोग कर अंत: स्रावी गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गयाकर्नल। पृष्ठभूमि और समापन बिंदु विशेष संदर्भ रसायनों के लिए खुराक प्रतिक्रिया क्यूए / क्यूसी दिशा निर्देशों विश्वसनीय माप के लिए आवश्यक समझा मुलाकात की। सतह के पानी के नमूने के लिए bioassay स्क्रीनिंग प्रतिक्रिया काफी हद तक पता लगाने योग्य नहीं था। इसके विपरीत, माध्यमिक उपचार संयंत्रों से प्रवाह के नमूने 392 एनजी dexamethasone / जीआर के लिए और ईआर के लिए एल 17 एनजी 17β-estradiol / एल अप करने के लिए अनुमानित bioassay बराबर सांद्रता (BEQs) के साथ, उच्चतम औसत दर्जे गतिविधि थी। एक तृतीयक प्रवाह नमूना के लिए bioassay प्रतिक्रिया माध्यमिक अपशिष्ट के लिए मापा तुलना में कम था, उन्नत उपचार के बाद अंत: स्रावी सक्रिय रसायन की एक निचली अवशिष्ट का संकेत है। इस प्रोटोकॉल से पता चला है कि इन विट्रो transactivation bioassays कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपयोग में, विभाजन गिरफ्तार सेल "" किट, पानी में अंत: स्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
मौजूदा पानी की गुणवत्ता की निगरानी सही और ठीक वन्य जीवन और मनुष्य के लिए जोखिम के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में रासायनिक contaminants की घटना के उपाय करने की क्षमता पर predicated है। हालांकि, इस रसायन-से-रासायनिक निगरानी और मूल्यांकन के प्रतिमान कभी बदलते रासायनिक ब्रह्मांड है कि हम सामना के साथ तालमेल नहीं रख सकते हैं। हम भाग्य और सिंथेटिक और प्राकृतिक रसायनों के प्रभाव के बारे में अधिक जानने के रूप में, हम माप उपकरण की उम्मीद पता है कि जैविक प्रभावों के लिए खोज करने के लिए जारी है, और है कि एक ही समय में रासायनिक उत्पादन, उपयोग और पर्यावरण इनपुट में परिवर्तन करने के लिए प्रतिरक्षा हैं। इस तरह के उपकरणों को समझने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक अज्ञात या नए रसायन, और परिवर्तन के उत्पादों, हमारे ध्यान देने लायक है कि क्या कर रहे हैं। इसके अलावा, पानी में मौजूद रसायनों के जटिल मिश्रण खराब व्यक्ति रासायनिक निगरानी से संबोधित कर रहे हैं। इस प्रकार, हम सतह के पानी Tha में इन मुद्दों को बेहतर पता करने के लिए मौजूदा निगरानी उपकरण बॉक्स के आधुनिकीकरण की चुनौती का सामनाटी में इलाज अपशिष्ट जल प्रवाह और शहरी / तूफानी जल अपवाह की मुक्ति प्राप्त करते हैं।
हाल के वर्षों में, रसायन तकनीक के पानी की गुणवत्ता के आकलन के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में वादा दिखाया है। विशेष रूप से, in'vitro bioassays कि ज्ञात के माध्यम से अभिनय रसायन का जवाब में कार्रवाई 1,2 के विशेष मोड पर्यावरण निगरानी समुदाय से 3 बहुत रुचि के हैं। कई जांच पीने, सतह और अपशिष्ट जल 4 -6 के अंत: स्रावी गतिविधि यों तो इन विट्रो bioassays में कार्यरत है। इसके अलावा, bioassays के एक नंबर आणविक की शुरुआत की घटनाओं (जैसे, रिसेप्टर सक्रियण) जो संभावित प्रतिकूल परिणाम मार्ग के माध्यम से हानिकारक प्रभाव से जोड़ा जा सकता का विश्लेषण करती 7.8 लक्ष्य।
पानी की गुणवत्ता के आकलन के लिए bioscreening के विकास अपेक्षाकृत तेजी से किया गया है, इन विट्रो bioassay समापन में विभिन्न के सैकड़ों के साथ के लिए मूल्यांकन किया गया हो रही उनकीउपयोगिता 9,10। वर्तमान में, केवल bioassays के एक मुट्ठी अच्छा माप परिशुद्धता (प्रयोगशालाओं के भीतर) प्राप्त करने के लिए, जबकि पानी गुणों 5,6 के बीच अंतर करने की क्षमता का प्रदर्शन दिखाया गया है। विशेष रूप से इलाज किया अपशिष्ट जल प्रवाह के लिए, एस्ट्रोजेन और glucocorticoid स्टेरॉयड की घटना को सफलतापूर्वक किया गया है विट्रो transactivation assays 11,12 में उपयोग करने के लिए जिम्मेदार है। हालांकि, आज तक का सबसे अध्ययनों से कार्यरत है bioassays जिसका सेल लाइनों मालिकाना (और इस प्रकार व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं) कर रहे हैं, निरंतर देखभाल और हेरफेर, या दोनों की आवश्यकता होती है। नतीजतन, क्षमता जल संसाधन समुदाय रुकावट बनी हुई है को यह स्क्रीनिंग तकनीक हस्तांतरण करने के लिए प्रोटोकॉल का मानकीकरण करने, इंटर-प्रयोगशाला अंशांकन व्यायाम प्रदर्शन, और अंततः।
इन विट्रो bioassays अमेरिका ToxCast कार्यक्रम के माध्यम से संचालित की कम से कम एक आपूर्तिकर्ता "फ्रीज पिघलना और व्यावसायिक तौर पर उपयोग करने के लिए आसान में उपलब्ध 13 है4; प्रारूपों। ये विभाजन गिरफ्तार सेल "किट" उपचार 14 के विभिन्न स्तरों का प्रतिनिधित्व पानी से निकाला रसायनों की गतिविधि को मापने में मजबूत होना दिखाया गया है। हालांकि विक्रेता प्रोटोकॉल अलग-अलग रसायनों या मिश्रण के bioactivity स्क्रीन करने के लिए उपलब्ध हैं, उनमें से कुछ संशोधन की आवश्यकता से पहले वे पानी के नमूने के लिए लागू किया जा सकता है। इलाज किया अपशिष्ट जल प्रवाह 15, तूफानी जल अपवाह 16, पानी प्राप्त 17,18 और अधिक हाल ही में साफ पानी 19,20 कि पानी की गुणवत्ता समुदाय के हित के लिए जलीय मीडिया के प्रमुख उदाहरण हैं।
इस अध्ययन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध का उपयोग कर पानी के नमूनों में अंत: स्रावी गतिविधि को मापने के लिए एक एकल, मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, विभाजन गिरफ्तार विट्रो transactivation bioassays में। हम पृष्ठभूमि, खुराक responsivity और tw के लिए प्रतिक्रिया की repeatability की एक व्यापक मूल्यांकन के माध्यम से प्रोटोकॉल की मजबूती का प्रदर्शनविशेष रुचि एस्ट्रोजेन रिसेप्टर और Glucocorticoid transactivation (ईआर और जीआर, क्रमशः) के ओ समापन। प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया में सिस्टम मीठे पानी से इलाज अपशिष्ट जल प्रवाह और सतह के पानी के नमूने स्क्रीन करने के लिए लागू किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे 17β-estradiol (E2), एनजी / एल सांद्रता 23,24 पर इन रसायनों के लिए वारंट स्क्रीनिंग के रूप में पर्यावरण एस्ट्रोजेन, की अच्छी तरह से प्रलेखित शक्ति। इस अध्ययन में, अपशिष्ट जल अपशिष्ट के लिए ईआर प्रतिक्रिया (BEQ रे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
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