والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار
Summary
الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي شبكات من الحمض النووي، الهستونات والبروتينات العدلة. على الرغم من أن المكون من الاستجابة المناعية الفطرية، وتورط المستجدة في المناعة الذاتية وتجلط الدم. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل العدلات الكلاب وتقدير من المستجدة باستخدام فحص صفيحة مضان.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
وهناك أكثر من 70 مليون الكلاب الاليفة في الولايات المتحدة وحدها 1. كأعضاء أسرة الكرام، هذه الحيوانات غالبا ما تلقي الرعاية الطبية خفض الحافة. على قدم المساواة لأنهم مشاركة بيئتنا، يمكن أن الكلاب أن تساعد في فهم المرضية والعلاج من الأمراض التي تصيب البشر 1. ومع ذلك، ما إذا كانت ترجمة الاكتشافات في الطب البشري في العلاجات البيطرية أو العكس بالعكس، فمن المهم أن تميز الاختلافات الأنواع حتى في أنظمة الحفظ للغاية تماما مثل الاستجابة المناعية الفطرية. وتشمل الأمثلة على الاختلافات بين الكلاب ونظام المناعة الفطري البشري العالي التعبير CD4 على العدلات الكلب 2. غياب homolog الوظيفي للاستشعار فلاجيلين حشوية IPAF في الكلاب 3 والتعبير عن هجين كاسباس 1/4 في الحيوانات آكلة اللحوم (4).
الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي عنصر المكتشفة حديثا نسبيا من مناعة فطرية 5. المستجدة هي شبكةالصورة من الحمض النووي والبروتينات النووية والحبيبية صدر ردا على مجموعة واسعة من التهابات أو المعدية المحفزات 6. وقد أثبتت يشبه الهياكل NET عبر العديد من الأنواع بما في ذلك الدجاج 7، 8 الأسماك والرخويات 9 و 10 acoelomates، ولكن هناك اختلافات الأنواع. على سبيل المثال، العدلات الفئران تستجيب ببطء أكثر للمؤثرات NETosis من العدلات الإنسان، وتشكل المستجدة أقل منتشر 11. وهناك مجموعة كبيرة من الأدلة من الأنواع المتعددة التي المستجدة إيقاع الميكروبات، وأكثر إثارة للجدل يمكن أن تشارك مباشرة في قتل مسببات الأمراض 12،13. ومع ذلك، مكونات NET أيضا تعزيز تلف الأنسجة، وتشجيع تخثر الدم ويكون بمثابة مستضدات الذاتية 14،15. قد تختلف التوازن بين الآثار المفيدة والضارة للالمستجدة بين الأمراض المختلفة والأنواع المختلفة، مما يدل على أنه من المهم للتحقيق المستجدة في كل من الأنواع وحالة من الفائدة.
نحن هناوصف بروتوكول بسيط لإحداث وقياس الافراج عن المستجدة التي كتبها العدلات الكلاب. هذه الطريقة مشابهة لتلك المستخدمة لعزل العدلات 16 و حمل NETosis في الأنواع الأخرى، ولكن الظروف مثل تركيز ناهض وفترة حضانة وقد تم تحسين لالعدلات الكلاب. كما تم وصف مماثل NET الكمي الحمض النووي الإفراج فحص في الأنواع الأخرى ولكن الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل أيضا للكلاب 8،17،18.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص الحمض النووي الإفراج قدم هو فحص للقياس بسهولة للالحمض النووي خارج الخلية. تم تعديل طريقة من تقنيات مشابهة تستخدم لتقييم تشكيل NET في الأنواع الأخرى، ولكن تم تغيير السرعات الطرد المركزي، وتركيزات ناهض وحضانة مرات لتحسين طريقة للاستخدام مع العدلات الكلاب 8،17،18.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?. Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
