호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
호중구 세포외 트랩은 감염 및 염증 자극에 반응하여 방출되는 DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. NET은 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만 자가면역 및 혈전증을 포함한 다양한 질병 과정과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 마이크로플레이트 형광 분석을 사용하여 개의 호중구 분리 및 NET의 정량화를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 혈액은 기존의 정맥 천자 기술을 사용하여 수집합니다. 호중구는 덱스트란 침전(dextran sedimentation)과 개의 혈액에 최적화된 조건을 사용하여 밀도 구배(density gradient)를 사용하여 분리됩니다. 96웰 플레이트의 웰에 부착할 시간을 허용한 후, 호중구는 phorbol-12-myristate-13-acetate 또는 혈소판 활성화 인자와 같은 NET 유도 작용제로 치료합니다. DNA 방출은 세포 불투과성 핵산 염료의 형광으로 측정됩니다. 이 분석법은 NET 방출을 정량화하는 간단하고 저렴한 방법이지만, 다른 세포 사멸 원인보다는 NET 형성을 대체 방법으로 확인해야 합니다.
서론
만 70 애완 동물 개 1 혼자 미국에 있습니다. 소중한 가족으로,이 동물은 종종 가장자리 치료를 절단받을 수 있습니다. 그들은 우리의 환경을 공유 마찬가지로 때문에, 개는 인간의 질병 1의 병인과 치료에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 의학적 치료 또는 그 반대에 인간 의약 발견 변환 여부는 완전히 같은 선천성 면역 반응 심지어 고도로 보존 시스템 종 변형을 특성화하는 것이 중요하다. 송곳니와 인간의 선천성 면역 시스템 사이의 차이의 예는 개 호중구 (2) 높은 표현 CD4을 포함한다; 개 3의 세포질 플라 젤린 센서 IPAF의 기능 동족체의 부재와 육식 4에서 카스파 제 1/4 하이브리드의 표현.
호중구 세포 트랩 (그물) 선천성 면역 (5)의 비교적 최근에 발견 된 구성 요소입니다. 그물 네트워크입니다감염성 또는 염증성 자극 (6)의 넓은 범위에 응답하여 해제 DNA, 핵 단백질의 입상. NET 같은 구조 닭 7, 8 물고기, 연체 동물류 (9, 10)을 포함하는 많은 종 acoelomates 통해 입증되었....
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프로토콜
모든 실험은 아이오와 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 윤리적 허가 하였다.
1. 혈액 컬렉션
- 직접 항응고제로 복재, 두부 또는 경정맥에서 혈액의 9 ml의 그리기 (예를 들어, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1.8 mg의 K 2 EDTA / ml의 혈액) vacutainers, 또는 EDTA 함유 혈액 튜브에 즉시 전송 주사기로. 부드럽게 굴러 또는 혈액 항응고제의 적절한 혼합을 보장하기 위해 혈액 튜브를 반전한다.
2. 호중구 격리
- 한 50㎖ 원추형 튜브에 멸균 실온 동량 혈액을 3 % 혼합하여 부드러운 반전 덱스-500 (0.9 % 멸균 식염수에 만든). 실온에서 18 ~ 20 분 동안 똑바로 서 둡니다. 그것은 더 이상 낮은 적색 층에 의해 오염없이 수집 할 수 없습니다 때까지 새로운 튜브에 밀짚 색깔의 상위 계층을 전송합니다. 일의 적혈구즉 원래 튜브는 폐기 될 수있다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 500 XG에 뜨는을 원심 분리기. 오프 그리기 및 상층 액을 버린다. 수동 10 ㎖를 실온 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포 펠렛을 다시 일시. 그 텍싱이 프로토콜의 모든 단계에서 다시 ....
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결과
이 프로토콜을 이용하여, 양성 대조군, 및 PAF PMA로 호중구를 자극 후의 형광 강한 배의 변화가있을 것이다. 비 자극 세포 (범위 2.0-5.8, N = 5 개) 18에 비해 형광의 평균 4.0 배 증가에서 1 시간 결과 31 μM PAF와 그림 1B, 송곳니 호중구의 자극에 도시 된 바와 같이. 0.1 μM (도 1a)에서 PMA 2 시간까지 형광을 증가시키지 않는 느린 작용제하지만 궁극적 유사한 배 형광 증가 생성 (평균 : 3.3 범위 1.36-5.4, N = 5 마리) 18. PAF가 높은 농도에 비해 비교적 저렴하고 광범위 뮤린 및 인간 연구에 사용되었다 : 그 느린 반응 속도에도 불구하고, PMA 장점은 양성 대조군으로 존재한다.
핵산 염료의 형.......
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토론
제시된 DNA 분리 분석은 세포 DNA에 대한 용이 한 정량 분석한다. 이 방법은 다른 종에서 NET 형성을 평가하기 위해 사용 된 유사한 기술에서 채택되었지만, 원심 속도 작용제 농도와 항온 처리 시간은 개과 호중구 8,17,18 함께 사용하기위한 방법을 최적화하기 위해 변경되었다. 유사한 조정이 다른 종의 방법을 적용하도록 할 수있다. 분석은 유동 세포 계측법 또는 이미지 분석으로 NETosis을 측정하는 다른 방법에 비해 간단하고 저렴하다. 또한,이 방법은 상업적으로 생산 누구를 검증 종 반응 항체가 종종 사용할 수없는 위해 이렇게 개에 사용하기에 이상적입니다 NET 구성 요소에 대한 항체를 필요로하지 않습니다.
이 방법의 중요한 한계는 NET 형성 세포 투과성 핵산 염료의 특이성이 부족하다. 이 염료는 죽고 죽어가는 세포, 바인딩 DNA를 입력하고 형광. 따라서, FLuorescence는 NET 형성을위한 특정하지 않습니다. 시각적으로 작용 물질이 .......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
저자는 개 호중구 프로토콜 개발에 도움을 준 James Roth, William Nauseef 및 Kayoko Kimura 박사와 Tom Skadow 박사에게 감사를 표합니다. RDG는 Wellcome Trust Fellowship 참조: WT093767MA의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 스프레이 코팅된 플라스틱 전혈관 K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | ||
| 인산염 완충 식염수 | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| 소 태아 송아지 혈청, 열 비활성화 | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, 페놀 레드 또는 L-글루타민 없음 | ThermoFisher scientific | 32404-014 | 페놀 레드 |
| 96 웰 플랫 바닥 멸균 폴리스티렌 플레이트 | |||
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| 혈소판 활성화 인자 | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX 녹색 핵산 염색 | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 다중 모드 리더 | BioTek | NA |
참고문헌
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant a....
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재인쇄 및 허가
