개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 간단한 형광 분석
Summary
호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
만 70 애완 동물 개 1 혼자 미국에 있습니다. 소중한 가족으로,이 동물은 종종 가장자리 치료를 절단받을 수 있습니다. 그들은 우리의 환경을 공유 마찬가지로 때문에, 개는 인간의 질병 1의 병인과 치료에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 의학적 치료 또는 그 반대에 인간 의약 발견 변환 여부는 완전히 같은 선천성 면역 반응 심지어 고도로 보존 시스템 종 변형을 특성화하는 것이 중요하다. 송곳니와 인간의 선천성 면역 시스템 사이의 차이의 예는 개 호중구 (2) 높은 표현 CD4을 포함한다; 개 3의 세포질 플라 젤린 센서 IPAF의 기능 동족체의 부재와 육식 4에서 카스파 제 1/4 하이브리드의 표현.
호중구 세포 트랩 (그물) 선천성 면역 (5)의 비교적 최근에 발견 된 구성 요소입니다. 그물 네트워크입니다감염성 또는 염증성 자극 (6)의 넓은 범위에 응답하여 해제 DNA, 핵 단백질의 입상. NET 같은 구조 닭 7, 8 물고기, 연체 동물류 (9, 10)을 포함하는 많은 종 acoelomates 통해 입증되었지만 종 차이가있다. 예를 들어, 쥐의 호중구 인간 호중구보다 NETosis 자극에 더 느리게 응답, 덜 확산 그물 (11)을 형성한다. 그물 직접 병원균 12,13 죽이는 데 관여 할 수 이상의 논쟁 미생물 포획, 복수 종 증거하는 큰 몸체있다. 그러나 NET 구성 요소는 또한, 조직 손상을 강화 14, 15을자가 항원으로 혈전증 행동을 촉진. 그물의 유익하고 해로운 영향 사이의 균형은 종과 관심의 조건에 모두 그물을 조사하는 것이 중요하다 제안, 다른 질병과 다른 종 사이에 차이가있을 수 있습니다.
여기에 우리유도와 송곳니 호중구 그물의 방출을 측정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 호중구 (16)을 분리하여 다른 종 NETosis을 유도하기 위해 사용 된 것과 유사하지만, 이러한 효능 제 농도 및 배양 시간 등의 조건은 개과 호중구에 대해 최적화되었다. 유사한 NET 정량화 DNA 분리 분석은 다른 종에서 설명되었지만, 여기에 제시된 방법은 또한 개 8,17,18에 최적화되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 DNA 분리 분석은 세포 DNA에 대한 용이 한 정량 분석한다. 이 방법은 다른 종에서 NET 형성을 평가하기 위해 사용 된 유사한 기술에서 채택되었지만, 원심 속도 작용제 농도와 항온 처리 시간은 개과 호중구 8,17,18 함께 사용하기위한 방법을 최적화하기 위해 변경되었다. 유사한 조정이 다른 종의 방법을 적용하도록 할 수있다. 분석은 유동 세포 계측법 또는 이미지 분석으로 NETosis을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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