Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Summary

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4⁺ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOG_tag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG_1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOG_tag or MOG_1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOG_tag protein. Immunization with either MOG_tag or MOG_1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduction

A esclerose múltipla é uma doença humana caracterizada pela inflamação crónica e neurodegeneração do SNC, que é pensado para ser impulsionado por uma resposta auto-imune dirigida à mielina. A perda de mielina e axônios ao longo do tempo como resultado a redução gradual da função cognitiva e motora ^1. "Encefalomielite autoimune experimental" é um termo genérico para modelos animais de doença auto-imune dirigida para a mielina do SNC. Como MS humanos, a EAE é tipicamente caracterizada pela infiltração de células imunes do sistema nervoso central e, em alguns casos, ² desmielinização. No entanto, o grau a que um determinado modelo de EAE se assemelha a MS humana, em parte, depende da espécie ou estirpe utilizada e da complexidade da resposta auto-imune anti-mielina subjacente.

auto-imunidade anti-mielina pode ser experimentalmente induzida de várias maneiras, mas o método mais comum utilizado hoje em dia é para imunizar ratinhos com um péptido curto de aminoácidos imitando o CD4 imunodominante <saté> + epítopo de célula T de uma proteína de mielina. Isto representa o requisito mínimo para induzir uma resposta patogénica. Talvez o mais comum destes é um péptido de 21 aminoácidos derivado de glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG _35-55), que é utilizado para induzir a EAE em ratinhos C57BL / 6 ^3. No entanto, para alguns fins experimentais é desejável ou mesmo necessário para imunizar com antígenos proteicos maiores e, de fato, existem várias vantagens para este mais de imunização com péptido curto. Em primeiro lugar, devido à restrição de MHC, os péptidos curtos são geralmente eficazes apenas num intervalo muito limitado de estirpes, enquanto antigénios proteicos maiores que representa tanto toda a proteína ou um domínio específico pode ser processada normalmente para a apresentação em múltiplas estirpes de ratinhos consanguíneos ou mesmo em diferentes espécies ^4. Em segundo lugar, um antigénio de proteína maior é capaz de induzir uma resposta imune mais complexo que incorpora mais tipos de linfócitos no reconhecimento do antigénio, em vez de limiting reconhecimento do antigénio às células T CD4 ^+. Por exemplo, as células B através do seu receptor de célula B (BCR) interagir directamente com todo e não processadas proteína. Nós e outros autores mostraram que as células B activadas por MOG _35-55 imunização não reconhecem proteínas MOG ^5. Uma vez que as células B foram recentemente demonstrado desempenhar um papel patogénico no MS humano ^6, modelos de EAE que incorporam as células B na patologia auto-imune são cada vez mais importante.

Apesar das vantagens da utilização de antigenes de proteínas maiores para induzir a EAE, continuam a existir algumas fontes comercialmente disponíveis para essas proteínas. Com efeito, enquanto que os péptidos curtos como MOG _35-55 pode ser sintetizada muito rapidamente e com um custo relativamente baixo, as opções para a proteína comerciais MOG são limitados e custo substancialmente mais para comprar. No entanto, existem vários vectores de expressão disponíveis para grupos de pesquisa para gerar MOG domínio extracelular (MOG _1-125) próprios. however, todos os sistemas de expressão que identificamos na literatura são baseados em tecnologias mais antigas que já foram substituídos por sistemas de expressão mais eficientes ^7. Além disso, a maioria são baseados em rato ou humana MOG ^8. Para algumas investigações de auto-imunidade em ratinhos, um antigénio com base no auto-antigénio de rato MOG é preferível. Finalmente, todas as proteínas baseados no MOG que identificámos, quer comerciais ou como vectores de expressão, são proteínas de fusão contendo aminoácidos adicionais para a base de MOG _1-125. Estes incluem um tag para a purificação e, geralmente, outras sequências, bem como, muitos dos quais com uma função não fomos capazes de identificar.

Para resolver estas limitações, geramos uma proteína de fusão romance baseado no mouse MOG domínio extracelular fundido a um tag contendo tioredoxina para combater a insolubilidade conhecida de proteína MOG ^5. A sequência de marcador contém ainda uma sequência de 6xHis para a purificação e uma protease TEV CLEAvage local que permite a remoção completa de todas as sequências de marcador, se desejado. Este é o único método que estamos cientes de gerar pura proteína MOG _1-125. Para facilitar a produção de grandes quantidades de proteína, a sequência de MOG _1-125 foi codões optimizados para a expressão bacteriana e a proteína de fusão _tag MOG foi inserida no sistema de expressão pET-32. Aqui, descrevemos detalhadamente o protocolo para produzir e purificar proteínas _tag MOG, e MOG puro _1-125, usando equipamentos não-especializados disponíveis para a maioria dos laboratórios de imunologia.

Protocol

Indução 1. Proteína NOTA: Nos passos seguintes, as bactérias Escherichia coli BL21 transformada com um vector pET-32 que contém a sequência para a proteína de fusão tag MOG (ver referência 5 e a Figura 1) são cultivadas a elevadas densidades e são então induzidas para expressar a proteína com cauda MOG . Veja a Figura 2 para o cronograma geral – note que dias são pontos de parada aproxima…

Representative Results

Uma vez que a purificação está completa, as amostras recolhidas nos passos 1.4, 2.1, 3.4, e o produto final da etapa 6.4 devem ser corridos num gel de proteína (Figura 3A). Tag MOG primeiro deve aparecer como uma banda de 31,86 kDa na amostra T O / N, mas não t 0, e deve ser a única banda no produto final puro. Para testar se a proteína com cauda tem MOG correctamente dobrada, a proteína com cauda MOG pode se…

Discussion

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a produção de proteína com _cauda MOG e como gerar puro MOG _1-125 da proteína com _cauda MOG. Este protocolo baseia-se tanto em métodos padrão His-tag com base de purificação de proteínas, bem como um protocolo anteriormente descrito para a geração de uma proteína com base ^MOG-15 mais velhos. Embora não seja descrito aqui, a utilização principal da proteína com _cauda é a MOG para induzir EAE por imunização co…

Materials

BL21 E.coli– pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375