제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 중요한 모델로 부상하고 있습니다. 지질이 풍부한 유충 사료의 프로토콜, 식이 형광 지질 유사체의 실시간 이미징 및 음식 섭취의 정량화가 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 다양한 스크리닝, 이미징 및 가설 기반 조사 기술에 적용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화
이 논문에서
요약
초록
제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 모델로 부상하고 있습니다. 이 프로토콜은 유충 제브라피쉬에게 배아 배지에서 달걀 노른자를 초음파 처리하여 생성된 닭고기 달걀 노른자 리포솜의 에멀젼으로 구성된 지질이 풍부한 식사를 먹이는 방법을 설명합니다. 먹이를 먹지 못한 유충이 실험 결과를 혼동하지 않도록 유충의 달걀 노른자 섭취를 선별하기 위한 자세한 지침이 제공됩니다. 닭 달걀 노른자 리포좀에는 지방산 및 콜레스테롤을 포함한 형광 지질 유사체가 첨가될 수 있어 식이 지질 처리의 전신 및 세포 내 시각화가 가능합니다. 고배율 및 저배율에서 직립 및 반전 대물렌즈를 모두 사용하여 단기 및 장기 라이브 이미징에 도움이 되는 유충을 장착하기 위한 몇 가지 방법이 설명됩니다. 또한 형광 지질 유사체를 먹인 유충의 지질을 추출하고, 박층 크로마토그래피 플레이트에서 지질을 발견하고, 형광을 정량화하여 유충 먹이 섭취량을 정량화하는 분석법이 제시되어 있습니다. 마지막으로, 절차의 중요한 측면, 중요한 제어 항목, 특정 실험 질문을 해결하기 위해 프로토콜을 수정하는 옵션 및 잠재적 제한 사항에 대해 논의합니다. 이러한 기술은 집중적이고 가설에 기반한 조사뿐만 아니라 식이 지질 대사 및 음식 섭취 조절을 연구하기 위한 다양한 화면 및 실시간 이미징 기술에도 적용할 수 있습니다.
서론
소장식이 지질 처리를 규제하는 메커니즘은 간 복합 지질 단백 합성 및 대사 조절, 이들 기관은 음식 섭취를 조절하는 중추 신경계 작동 방법 불완전하게 이해된다. 또한 비만, 심혈관 질환, 당뇨, 비 알코올성 지방간 질환의 현재 유행의 빛이 생물 해명 생의학 관심사이다. 세포 배양에서 연구와 마우스는식이 지질과 질병, 그리고 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 사이의 역학적 관계에 대한 우리의 이해의 대부분을 제공 한이 작품을 보완하는 이상적인 모델로 부상하고있다.
제브라 피쉬는 높은 척추 동물 1, 2와 유사한 위장관 (GI) 기관, 지질 대사 및 지질 단백질 수송을 신속하게 개발 및 유전자 다루기 쉬운입니다. 애벌레 제브라 피쉬의 광학 선명도가 생체 내 연구에 용이하게하는 particula그 외 환경로 GI 시스템의 연구 연구의 장점 (즉, 담즙, 미생물은 내분비 시그널링)은 생체가. 따라서, 유전자 취급 용이성 및 conduciveness 조합 연구의 본체와 제브라 애벌레의 촬상 라이브 모델 사실상 불가능 식이 조작 (고지방 3,4, - 콜레스테롤 5, -carbohydrate 다이어트 6,7....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜은 과학 기관 동물 관리 및 사용위원회 카네기 연구소 (프로토콜 없음. 139)에 의해 승인되었습니다.
1. 동물 준비
- 14 시간에 28 ° C에서 성인과 애벌레 유지 : 10 시간 빛 : 어두운주기를. 쉘 무료 아테 미아 (디 캡슐 레이트, 비 부화, 14 DPF에서 시작) 및 상업 micropellets으로 하루에 두 번 성인 피드.
- 이 프로토콜은 AB 배경의 자연 산란에 의해 수집 6-7 DPF 유충의 사용에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 다른 연령대와 배경의 유충에 대한 수정 될 수 있습니다. 외래 음식을 이전 6 DPF를 제공하지 않습니다.
- 배아 매체 Tricaine (EM)와 유충 실온 (RT) (4 mg을 100 ㎖의 EM 당 / ㎖ Tricaine 4.2 ㎖) 마취.
지질이 풍부한 달걀 노른자 피드 2. 준비
- 준비하고 닭고기 달걀 노른자를 저장합니다. 12 닭고기 달걀의 노른자와 흰색을 구분합니다. , 나누어지는 1 ml의 1.5에 노른자를 풀1 년에 -80 ° C 최대의 ML의 튜브, 저장 (12 노른자는 ~ 80 분취를 만들 것입니다). 백인, 저장 수영장, 지질 가난한, 단백질이 풍부한 사료로....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
29 ~ 31 ° C에서 로커에 공급되면, 건강 유충 (≥95 %)의 대부분이 1 시간 내에 먹는다. 계란 노른자 에멀젼을 소모하면, 애벌레 소장 컬러로 어둡게. 아주 어두운 장 2 시간 (그림 1)에서 관찰 할 수있다. 애벌레 unfed 또는 공급하지 않을 경우, 소장은 분명 남아있다. 애벌레 먹이 계란 흰자 전시 컬러로 어둡게하지 않는 팽창 장 루멘.
그림 1 :. 식품 섭취를 위해 애벌레를 선별 야생 타입 6-DPF 유충은 2 시간 동안 EM 5 % 달걀 노른자를 공급 또는 unfed 컨트롤을 얻기 위해 EM에서 병렬로 처리 하였다. 입체경에 10 배에서 몇 군데 때 계란 노른자를 섭취 한 먹이 애벌레 어두운 장을하면서 Unfed 유.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 설명 된 기술은 연구자, 지질이 풍부한 피드 유생 제브라 치료 라이브 유충식이 지질을 시각화 처리 한 애벌레 음식 섭취를 정량화 할 수있다. 성공을 보장하기 위해 특별한주의는 몇 가지 중요한 단계에 주어져야한다. 상업 닭고기 달걀 변화; 잠재적 인 변동성을 최소화하기 위해 우리는 오메가 -3 지방산에 대한 풍부한되지 않은 케이지가없는 닭에서 유기농 계란에 대한 모든 분석을 수행합니다. 낮은 공급 속도 미만 6 음식 섭취 (즉, 턱 또는 소장 기형, 제대로 수영을 할 수없는)을 방해 발달 돌연변이 내생 노른자 에너지 공급, 건강에 해로운 고기, 생선 남아와 DPF 물고기를 관찰 할 수있다. 자신의 내생 노른자 저장이 소진되고 노른자 고갈이 소화 시스템을보다 효율적으로 시각화 할 수 있습니다 때까지 애벌레 외래 음식을 필요로하지 않기 때문에 파버 연구소는 일반적으로 6~7일 게시물 수정 (DPF)에 공급하는 연구를 수행한다. 급송RT에서도 크게 먹는 애벌레의 수를 줄일 수 있습니다. 음식 섭취량과 결과를 혼.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 이미지를 제공해 준 Meng-Chieh Shen, 원고에 도움이 되는 설명을 제공해 준 Jennifer Anderson, 이러한 기술을 개발하는 데 기여한 Farber 연구소 구성원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NIDDK-NIH 상 RO1DK093399(S.A.F.), RO1GM63904(제브라피시 기능 유전체학 컨소시엄: PI Stephen Ekker 및 Co-PI S.A.F) 및 F32DK096786(J.P.O.)의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation은 S.A.F 실험실과 Carnegie Institution for Science 기부금에 추가 지원을 제공했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄술로프네이트 염) | 시그마-알드리치 | A5040-25G | 유충 제브라피 |
| 마취 닭고기 달걀 | 해당 없음 | 유기농, 케이지 프리 달걀, 오메지-3 지방산에 농축되지 않음 | |
| 초음파 처리기 3000 초음파 처리기 | Misonix, Inc. | S-3000 | 달걀 노른자 리포좀을 만들기 위해 |
| Sonabox 음향 인클로저 | Misonix, Inc. | 432B | 달걀 노른자 리포솜 |
| 1/8" 테이퍼 마이크로팁 | Misonix, Inc.를 | 419 | 달걀 노른자 리포솜을 만들기 위해 |
| 호박색 바이알 (4 ml, 유리) | National Scientific | 13-425 | 지질 저장; 바이알, 오픈-탑 캡, 캡 셉타 |
| 포함 Incu-Shaker Mini | 벤치마크 | 1222U12 | 사료용 인큐베이션 쉐이커 |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | 형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-헥사데칸노산) |
| 바디피 FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | 형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-도데판산) |
| 바디피 FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | 형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜탄산) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | 형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산) |
| TopFluor 콜레스테롤 | 아반티 폴라 지질 Inc. | 810255 | 형광 지질 유사체; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| 지방산-무료 BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | TopFluor 콜레스테롤 용해화용 |
| 메틸 셀룰로오스 | Sigma-Aldrich | M0387 | 살아있는 애벌레 이미징을 위한 마운팅 미디어; 75 x 25 x 1 mm |
| 저용융 아가로스 | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | 살아있는 애벌레용 마운팅 미디어 이미징; 22 x 30 |
| VWR 현미경 슬라이드 | 폭스바겐 | 16004-422 | 라이브 이미징을 위한 마운팅 애벌레 |
| Coverslips | 커버 유리 | 12-544A | 라이브 이미징을 위한 마운팅 애벌레 |
| 슈퍼 글루 | Loctite | LOC01-30379 | 라이브 이미징을 위한 마운팅 애벌레 |
| FluoroDish (유리 바닥 접시) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | 실시간 이미징을 위한 장착 애벌레; 35 mm 접시, 23 mm 유리, 0.17 mm 유리 두께 |
| 컨포칼 현미경 | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | 현미경은 고배율 라이브 이미징을 위한 |
| 스테레오스코프 | Nikon | SM21500 | 배율 라이브 이미징을 위한 |
| 유리 배양 튜브 | Kimble | 73500-13100 | 지질 추출; (13 x 100mm, 13ml) |
| Savant SpeedVac 플러스 | ThermoQuest | SC210A | 지질 추출 |
| 채널 TLC 플레이트 | Whatman Scientific | WC4855-821 | 식품 섭취 분석; LK5D 실리카겔 150A, 20 x 20cm, 250um 두께; 단종 |
| 채널 TLC 플레이트 | Analtech, Inc. | 66911 | 식품 섭취 분석; Whatman Scientific TLC 플레이트의 직접 교체 |
| Typhoon 9410 가변 모드 이미저 | GE Healthcare | 9410 | 식품 섭취 분석용 형광판 판독기 |
| ImageQuant 소프트웨어 | GE Healthcare | 29000605 | 식품 섭취 분석 |
| 분석 5 3/4' 넓은 구멍, 보로실리케이트 일회용 파스퇴르 피펫 | Kimble | 63A53WT | 이송 유충 |
참고문헌
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
