여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

요약

필터 카트리지로 물을 여과하고 필터를 제거하기 위해 하우징을 절단하지 않고도 환경 DNA(eDNA)를 추출하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 어류의 eDNA를 메타바코딩하기 위해 개발되었지만 다른 유기체의 eDNA에도 적용할 수 있습니다.

초록

최근 연구에서는 어류의 환경 DNA(eDNA)를 비침습적 모니터링 도구로 사용하는 것이 적절하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 디스크 섬유 필터를 사용하여 물 샘플에서 eDNA를 수집했지만, 수중 환경에 대한 많은 미생물 연구에서는 카트리지 카트리지를 사용했는데, 그 이유는 카트리지가 많은 양의 물을 수용하고 전반적인 사용 편의성을 가지고 있기 때문입니다. 여기에서는 필터 카트리지를 사용하여 물 샘플을 여과하고 하우징을 절단하지 않고도 필터에서 eDNA를 추출하는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 부분은 1) 물 샘플의 여과 (물의 양 ≤4 L 또는 >4 L)로 구성됩니다. (2) 예열된 인큐베이터에 놓인 롤러 셰이커를 사용하여 필터에서 DNA를 추출하는 단계; 및 (3) 상용 키트를 사용한 DNA 정제. 이 프로토콜과 이전에 사용된 프로토콜을 사용하여 알려진 종 조성으로 거대한 수족관 탱크(7,500m3)에서 채취한 eDNA의 메타바코드 분석을 수행하고 두 프로토콜에서 라이브러리당 검출된 종 수를 대표 결과로 표시합니다. 이 프로토콜은 어류의 eDNA를 메타바코딩하기 위해 개발되었지만 다른 유기체의 eDNA에도 적용할 수 있습니다.

서론

수생 환경에서 환경 DNA (에드나)는 물 칼럼에서 발견 된 유전 물질을 의미한다. 최근의 연구는, 연못 ^1-3, 강, ^4-8 등 다양한 수생 환경에서 물고기를 검출하는 에드나의 유용성을 입증 ^{9 스트림,} 해수 ^10-14. 최근의 연구는 생선 커뮤니티 ^7,9에서 여러 종의 동시 검출을 시도하면서 이러한 ^연구의 대부분은, ^3,9 종 단일 또는 소수의 침략 ^1,4-6,8,14 희귀 또는 위협의 탐지에 초점을 맞춘 ^12,13,15 및 반 폐쇄 생태계 ^{(11, 12).}

후자의 방법은 "metabarcoding"라고하며 에드나의 metabarcoding은 분류 학적으로 다양한 샘플에서 유전자 영역을 coamplify하는 PCR 프라이머의 하나 또는 여러 개의 세트를 사용합니다. 이것은 인덱싱 및 어댑터 첨가 라이브러리를 제조 하였다되고 인덱싱 라이브러리는 높은 처리량 병렬 염기 서열 분석플랫폼. 최근 미야 등. ⁽¹²⁾ ( "MiFish"라고합니다) 물고기에서 에드나를 metabarcoding에 대한 보편적 인 PCR ....

프로토콜

참고 :이 프로토콜은 물 샘플링 및 metabarcoding 방법과 거래를하지 않습니다. 물은 연구 목적 ^(16)에 따라 다른 방식으로 샘플링 볼 미야 등. ⁽¹²⁾ MiFish 프라이머를 사용하여 metabarcoding 방법에 대한 자세한 내용은 될 수있다. 샘플링 된 물이 매우 추운 유지와 에드나의 저하를 방지하기 위해 몇 시간 내에 필터링해야합니다. 또한,이 프로토콜은 회전 진탕 배양기와의 사용을 포함 유의, 후자는 전자를 수용 할만큼 충분히 커야한다. 또한, 원심 분리기는 원추형 튜브 후 여과 필터에 남아있는 액체를 제거하고, 각각의 카트리지 내에서 추출 된 DNA를 수집 불가결 모두 15 mL 및 50 mL로 수용 할 수있다.

1. 스크류 캡과 1 L 플라스틱 가방 처리

참고 : 여과 볼륨> 4 L. 경우이 단계를 건너 뛰

1. 나사 (C)의 중앙에 구멍을 뚫는다수형 루어 락 커넥터로부터 돌출 관과 동일한 직경 (4.8 mm)와 AP (L 1 회용 비닐 봉투에 부착). 대각선 집게를 사용하여 여과 한 후, 캡의 내부에 소량의 물 막힘을 방지하기 위하여 적절한 길이 (CA. 3mm)에 수형 루어....

결과

그것은 MiFish 프라이머는 조류와 포유류와 같은 일부 비 물고기 척추 동물에서 대상 지역을 coamplify 때문에 같은 크기의 PCR 제품, 분리 및 추출 된 대량 에드나 만 물고기 에드나를 정량화하는 것은 기술적으로 어렵다 (캘리포니아. 170 bp의 ) ^12. 대신 물고기 에드나를 정량화, 우리는 여과 및 DNA 추출의 두 가지 방법을 사용하여 알려진 종 구성 수족관 탱크에서 에드나의 분석을 metabarcoding MiFish을 수행하고,이 프로토콜에서 라이브러리 당 검출 된 종의 수를 비교합니다. 이 간단한 실험은 엄격하게 다른 사람을 통해 그 우수성을 보여주기 위해 "대표적인 결과"가 아니라 같은 본 프로토콜의 가능성을 보여주기 위해 설계되었습니다.

우리는 오키나와 츄라 우미 수족관, 오키나와.......

토론

물, 토양 등의 환경 시료를 사용하여 많은 metabarcoding 연구를 다음과 같이, 필터 카트리지의 후 여과 처리는 일반적으로 ^{24, 25} : 1)로 개방 절단 또는 손 도구 (튜브 커터 치)와 하우징 분해; 2) 필터 카트리지에서 제거; 3) DNA 추출을위한 면도날 작은 조각으로 절단 필터. 널리 사용되는 저가의 상용 키트를 사용하여 필터 카트리지의 하우징 내에 이러한 귀찮고 시간 소모적 인 실험실 오염되기 쉽다 절차 우리 시도 여러 DNA 추출 방법을 피하고 성공적 양호하여 본 프로토콜 개발하려면 에드나 metabarcoding 분석 결과 (그림 1).

본 프로토콜에서 더욱 중요한 단계 중 하나는 예열 된 인큐베이터에서 회전 진탕의 사용이다, 그 이후의 라이브러리 위해 준비 할 좋은 DNA 수율을 제공 할 수있다에드나 metabarcoding 분석 ATION. 최적의 온도에서 주택 내의 단백질 분해 효소-K 솔루션의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
메쉬 패널	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
금속 단자	Iris Ohyama	MR12F
메쉬 패널용 스탠드	없음	4184-9507	아마존 재팬에서 사용 가능
나사 캡이 있는 1L 비닐 봉지	Yanagi	DP16-TN1000
수 루어락 커넥터	ISIS	11620
10ml 피펫 팁	Eppendorf	0030 000.765
10 L 책 병	밸브 As One	1-2169-01
Sterivex-HV 필터	Millipore	SVHVL10RC	ms 동안 "필터 카트리지"로 표시되며 프로토콜에서 사용됩니다.
남성 루어 피팅	As One	1-7379-04
여성 루어 피팅	As One	5-1043-14
인레트 luer cap	ISIS	VRMP6
출구 luer cap	ISIS	VRFP6
고진공 튜빙	As One	6-590-01
진공 커넥터	As One	6-663-02
실리콘 스토퍼	As One	1-7650-07
매니폴드	As One	2-258-01
흡인기-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy 혈액 & 티슈 키트 (250)	Qiagen	69506
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