過分極¹³ C代謝磁気共鳴分光法とイメージング

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

過去数十年間では、腫瘍の病期分類、再病期決定、治療応答のモニタリング、および種々の癌の再発を検出するための新しい方法は^、18 F-フルオロ^（[18 Fと最先端の陽電子放射断層撮影法に関連して出現しています] -FDG PET）。 ¹³ C核磁気共鳴分光イメージング^（13 CMRSI）は、 インビボ及びリアルタイムでの代謝のモニタリングを可能にする低侵襲イメージング法です。 ¹³ C核磁気共鳴（NMR）に基づく他の方法と同様に、それが原因¹³ C及び低天然存在度の比較的低い磁気回転比で低熱分極とそれに続く低い信号対雑音比の挑戦に直面しています生物学的サンプル。これらの制限を克服することにより、後続のサンプルの溶解との動的核分極（DNP）は、最近、一般に有効測定するNMR及び磁気共鳴イメージング（MRI）システムを使用してい様々な生物学的システムでは、研究、および画像鍵代謝経路。過去10年間に、広く細胞のエネルギー代謝を調査するために、インビトロ 、前臨床に使用される、および、より最近では、臨床試験されている^、13 CMRSIある[1- ¹³ C]ピルビンで使用特に興味深く有望な分子癌および他の疾患インチこの記事では、我々は3.35 T前臨床DNPの超偏極を用いて、溶解DNPの技術の概要を説明し、in vitro試験におけるその使用法を示します。過分極のための同様のプロトコルは、同様のインビボ研究においてほとんどの部分に適用することができます。そうするために、我々は、乳酸脱水素酵素（LDH）を使用し^、13 CMRSIを使用して、in vitroでの前立腺癌細胞株、PC3、中[1- ¹³ C]乳酸に[1- ¹³ C]ピルビン酸の代謝反応を触媒しました。

Introduction

現在、癌の広範囲の腫瘍病期分類、再病期決定、治療応答のモニタリング、及び再発の検出のために最も広く使用されている臨床的方法は^、[18 F] -FDG PETです。 ¹しかし、最近、いくつかの新規および代替的なアプローチが出現しています。これらの方法の一つは^、13 CMRSIです。この技術は、リアルタイムで、インビトロまたはインビボでの代謝を評価するために、低侵襲MRI続いて生物学的サンプル中に¹³ C-分子の導入を含みます。それにもかかわらず、そのような^[18 F] -FDG PET又はコンピュータ断層撮影のような他の方法と比較して¹³ CMRSIの最大の課題は、低い信号対雑音比です。

NMR信号は、分極レベル、総人口の2つのエネルギー状態のスピン半核集団差の比（ 図1A）に正比例します。偏光は目の製品です。電子原子核の磁気回転比（γ）と温度に対する印加磁界の強さ。 ¹ H核の典型的な分極は、比較的低い信号対雑音比を与える3 Tに0.005％、0.001％程度です。今日の最先端のMRIのみによる生体試料中の¹ Hの高い豊かさと¹ H（γの_1H = 42.576 MHzで/ T）の高い磁気回転比に成功したイメージング方法でした。しかし、炭素などの他の核を、観察、より厳しいあります。唯一の安定した、磁気的に活性な炭素同位体^、13 Cは、すべての炭素原子のわずか1.1％を占めます。また^、13 _C（γ13C = 10.705 MHzで/ T）の磁気回転比は低い検出効率につながる^、1 Hのそれよりも4倍低いです。要約すると、低い¹³ Cの存在量および低い_γ13Cは熱¹³ C測定値が¹の感度の0.0176％に達成させin vivoでの H-NMR測定。

動的核分極

¹³ C測定の比較的低い感度を克服するための方法は、DNPです。もともとはアルバートW.オーバーハウザーによって1953年に金属について説明しました。彼の記事では、彼は述べた： "伝導電子の電子スピン共鳴が飽和している場合、核はその磁気回転比は、電子スピンのことであった場合、彼らは次のようになり、同じ程度に偏光されることが示されている^。「2その後その年、カーバーとスリクターは、実験的にオーバーハウザーの仮説^3を確認し^ました 。 1958年、Abragamとプロクターは、液体中の電子のためにこの効果を説明し、それを名前の「固体効果。」 4 K以下の温度で、電子スピン分極は、ほぼ100％に達し、核スピン分極（ 図^1B）4以下の大きさより3桁高いです。 T電子の磁気回転比_（γE = 28024.944 MHzの/ T）は、核磁気回転比よりも三桁であるため、彼が発生します。電子は、対応する電子に近い周波数でマイクロ波照射を使用して、核スピンへスピンから、このようなオーバーハウザー効果、固体効果、クロス効果、及び熱混合効果として電子と原子核との間の弱い相互作用は、偏光の転送を可能にします常磁性共鳴（EPR）周波数^5,6。 DNPの理論は、さらにより多くの電子および熱混合が関与するために開発されました。それにもかかわらず、現在までに、DNPの統一定量的な理論的な説明は^7,8を公開されていません。

図1：動的核分極および過分極を理解します。スピン人口のA）は概略比較熱平衡偏光状態と過分極状態インチB）偏光は、温度に依存しています。電子（E ^{– ）}の偏光は100％1.4 KでDNPの下に到達した電子から10 ⁵倍までの彼らの偏光を増加させる¹³ C核に分極の転送を可能にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

¹³ C NMRを用いて、生物学的システムの研究にDNPを導入するために、その後の迅速なサンプルの溶解を開発する必要がありました。オーバーハウザーの仮説、月H. Ardenkjaer-ラーセンら後の50年。最小限の過分極損失⁶で液体状態に過分極凍結サンプルをもたらす技術的に困難な問題を解決しました。解散DNPは¹³ CMRSと呼ばれる新しい研究分野を開きました私は、種々の疾患状態^9,10を調査し、特徴づけるための新しい方法を提供します。不対電子のように安定したキャリア、トリチルラジカルトリス（8-カルボキシ-2,2,6,6-テトラ（ヒドロキシエチル）-benzo- [1,2-4,5]ビス – （1,3） -dithiole -4-イル）メチルナトリウム塩（OX063）または（2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-イル）オキシル（TEMPO）は、通常使用されます。これらは、所望の¹³ C標識された分子と混合し、対応するEPR周波数に近い周波数でマイクロ波照射に曝露されます。この技術を用いて^、13 C核の分極を^37〜11％まで増加させることができます。これは、熱平衡偏光^11,12に比べて10 ⁵倍の偏光強化につながります。しかし、マイクロ波照射が停止され、及び/又は¹³ C-分子は液体状態に転送されるとすぐように、偏光を偏光された¹³ C核の縦緩和時間（T _1）で減衰します。このように、迅速な溶解技術の発明または実験測定までの時間を短縮し、後続の技術（ すなわち、注射）は、生物学的なアプリケーション¹³のために重要です。

候補分子が成功した¹³ CMRSIの研究のために満たすために必要な三つの主要な要件があります。まず、目的の¹³ C核が十分に長いT _1（> 10秒）を有していなければなりません。 ¹³ C-標識の選択は非常に重要です。最良の候補核が結合を介して ¹ H-核と直接接触を持つ炭素です。元の物質と有意に異なる化学シフト下流代謝産物を生じ、3 T ₁回-それはまた、急速に2内に代謝される必要があります。空間分布は、トランスを可能にする電子と¹³ Cとの間の距離を減少するように試料混合物は、固体状態で場合非晶質ガラスを形成しなければなりません偏光のFER。候補分子は、自然に非晶質ガラスを形成しない場合、それは、例えばグリセロールまたはジメチルスルホキシド¹⁴として、ガラス化剤中に高度に可溶性である必要があります。これらの要件は、候補分子が比較的少数で生じます。しかし、適切な分子の発見に成功した後、過分極のための作業プロトコルを開発することが^9,14,15技術的に挑戦することができます。

^{36、[2- 13} C]ピルビン酸^{37、[1- 13} C]ピルビン酸エチル^{38、[1- 13} C ^–近年では、いくつかの基板には、[1- ¹³ C]ピルビン酸^12,16として、正常に偏しています]乳酸^{39、[1- 13} C]フマル酸^{40から43、13} C-重炭酸塩^{36,44,45、[1- 13} C]酢酸ナトリウム^{43,46 – 49、13} C-尿素^6,36,50,51 、[5- ¹³ C] glutamineの^{15,52,53、[1- 13} C]グルタミン酸^{53,54、[1- 13} C] 2-オキソグルタル酸^{55、[1- 13} C]アラニン、およびその他^14,56。過分極に特に興味深く、一般的に使用される基板は、[1- ¹³ C]ピルビン酸塩です。広く種々の疾患^14,17,22における細胞のエネルギー代謝を調査するために前臨床試験で使用されています。 [1- ¹³ C]ピルビン酸は続いて代謝される前に、細胞膜を横切る比較的長いT ₁および迅速な輸送を含む成功した超偏極のためのすべての要件を満たしています。 [1- ¹³ C]ピルビン酸と前臨床研究は、現在、診療所⁵⁷に翻訳されています。

ピルビン酸の代謝

よく、癌細胞のDNAおよびそれらの代謝経路の変化の突然変異との間に直接的なリンクがあることが知られています。すでに1920年代、オットーウォーバーグdiscov^{60 –}健康な組織⁵⁸に比べて、腫瘍中の乳酸のグルコース生産の増加代謝があることをered。続いて、このようなペントース – リン酸経路、トリカルボン酸回路、酸化的リン酸化、ならびにヌクレオチドおよび脂質の合成のような他の代謝経路における種々の交替は、記載されています。

ピルビン酸は、解糖の最終産物です。腫瘍では、LDH ⁶¹によって触媒嫌気的解糖を受け、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元形態と反応し （NADH）、乳酸塩および補酵素（NAD ^+）の酸化型になります。あるいは、ピルビン酸は、アラニントランスアミナーゼ（ALT）によって触媒されるアラニンを形成するグルタミン酸転移反応を受けます。両方の反応は容易に可逆的です。ピルビン酸は、また、二酸化炭素およびアセチルCoA、rにピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）により触媒される脱炭酸を受けこの段階で不可逆的な反応をepresenting。これらの反応速度での交代は、腫瘍代謝^{17,21,22,25,62}にリンクすることができます。代謝経路を図2にまとめます。

図2：ピルビン酸の主要代謝反応のダイアグラム。ピルビン酸/乳酸変換はLDHにより触媒される、ピルビン酸/アラニンの変換はALTによって触媒されます。ピルビン酸は、不可逆的にPDHによって、およびCO ₂ -アセチルCoAに変換され、CO _2は重炭酸塩⁸⁰とのpH依存性平衡状態にあります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

過分極[1- ¹³ C]ピルビン酸塩及びその代謝産物の検出は、以前にラットにおいて実証されている彼芸術^{37,63 – 65、}肝臓^66、筋肉、および腎臓^62,67。ある研究では、正常と絶食ラットの肝臓⁶⁶との間に乳酸からアラニンへの比率に有意差を示し、肝癌^68,69に非常に上昇し、過分極[1- ¹³ C]乳酸レベルを示しました。腫瘍の悪性度を切除した腫瘍の組織学的悪性度と高い相関を示す過分極乳酸レベルで、過分極[1- ¹³ C]ピルビン酸^22を用いて、マウス前立腺（TRAMP）のトランスジェニック腺癌において同定することができるという証拠があります。 ALTによってピルビン酸から触媒アラニンはまた、ラットの肝細胞癌²³に有用なマーカーとして提案されています。

ピルビン酸、乳酸の代謝フラックスを測定するモニタリング虚血^63,65,70のための細胞傷害性化学療法^17,40、標的薬による治療への応答として使用されてきました<SUP> 24,25,41、または動物モデルでの放射線治療^26。また、神経膠芽腫および乳癌のマウスモデル²⁵におけるホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）阻害剤LY294002応答の検出のために使用されてきました。脳腫瘍²⁶および前立腺癌^24,71におけるピルビン酸代謝の変化はまた、治療後に観察されています。

前立腺癌

前立腺癌は、世界中の⁷²人の男性に死刑に関連する高齢男性と第二の主要癌における主要な癌です。現在まで、信頼性の高い、非侵襲的な方法は、患者の厳格な検出およびステージングを有効にするための新規な代謝イメージング技術のための緊急の必要性を強調し、前立腺癌^73,74の早期診断および特徴付けのために用意されていません。前立腺癌は、患者における¹³ CMRSIと組み合わせた溶解DNPの可能性を実証するためのモデルとして使用されました⁵⁷です。この作業は、[1- ¹³ C]ピルビン酸および前立腺癌のイメージングのための¹³ CMRSIを採用した最初の臨床試験で継続し、それは最近（NCT01229618）を完了したしました。

この作品の背後にある動機は、細胞を用いた前臨床設定で¹³ CMRSI法の適用をより詳細に、より広い聴衆のために説明することでした。 PC3前立腺癌細胞株のin vitroでの [1- ¹³ C]乳酸に[1- ¹³ C]ピルビン酸のLDH触媒による代謝を測定し、我々は、in vitro試験で溶解DNPの適用可能性を実証し、重要なステップに対応し、実験中の課題。

Protocol

1.サンプルストック溶液の調製 1-ミリモル/ L GadMの最終濃度が得られるように濃縮された[1- 13 C]ピルビン酸にgadoterateメグルミン（GadM、0.5モル/ L）を追加します。トリチルラジカルトリス追加（8-カルボキシ-2,2,6,6-テトラ（ヒドロキシエチル）-benzo- [1,2-4,5]ビス – （1,3）-dithiole -4-イル） – 15ミリモル/ Lの最終濃度を与えるために、この混合物にメチルナトリウム塩（OX063）。完全…

Representative Results

「マイクロ波スイープ」の結果は、図3に示されています。これは、[1- 13 C]ピルビン酸サンプルのための最適なマイクロ波の周波数がローカル3.35-Tの超偏極のための94.156 GHzであることを示しています。以下のすべての過分極実験（N = 14）は、100ミリワットの電力で、このマイクロ波周波数を使用して実施しました。マイクロ波照射は、90％より高い固体過分極につながる?…

Discussion

過分極プローブと¹³ CMRSIは、in vitroおよびin vivoでリアルタイムでの代謝をモニターするための有望な方法です。 1つの非常に重要な側面は、この実験的なプロセスを採用した場合は、特にインビトロ実験にについて、適切な標準化です。まず、試料の調製は、各実験において、超偏極物質の同じ濃度を達成するように適切にかつ一貫して行われる必要?…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS