Rolle sortiment (rumlig adskillelse) i evolutionære scenarier kan undersøges ved hjælp af simple mikrobielle systemer i laboratoriet, der tillader kontrolleret justering af rumlige fordeling. Ved at modificere grundlægger celletæthed kan forskellige sortiment niveauer visualiseres under anvendelse fluorescensmærkede bakteriestammer i kolonien biofilm af Bacillus subtilis.
Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.
I de sidste årtier har mikrober blevet anerkendt som sociale fællesskaber forbundet med forskellige økosystemer på jorden 1,2. I modsætning til planktoniske kulturer anvendes generelt laboratoriepraksis, mikrober i miljøet viser en bred vifte af rumlige samfundsstrukturer afhængigt af økologiske indstilling. Simple mikrobielle systemer kan anvendes til at forstå konsekvensen af rumlige strukturer af udviklingen af sociale interaktioner 3,4. Publikationer i de sidste 2-3 år ved hjælp både eukaryote og prokaryote modelsystemer fremhævet virkningen af rumlige strukturer på stabiliteten af samarbejde inden mikrobielle populationer 5-8. Derudover obligat interaktioner blandt mikrober, f.eks metaboliske cross-fodring, kan også ændre den rumlige fordeling af interagerende partnere 9-11. Indflydelsen af rumlig struktur i disse undersøgelser er for det meste undersøgt ved hjælp af overflade vedhæftet fastsiddende celler lever i så-kaldet biofilm eller i kolonier vokser på overfladen af et agarmedium. Genetisk drift resulterer i høj rumlig sortiment kan observeres i mikrobielle kolonier hvor næringsstof udtynding ved kanten af en celledeling medierede ekspansion resulterer i serie af genetiske flaskehalse, der forårsager høj lokal fiksering sandsynlighed for visse klonede linages 12. Genetisk drift kan derfor anvendes til at undersøge, hvilken rolle rumlig segregering i mikrobielle kolonier.
I miljøet, biofilm er flere arter samfund omgivet af egenproduceret polymermatrix 13. Biofilm struktur, funktion og stabilitet afhænger af et komplekst netværk af sociale interaktioner, hvor bakterier udveksle signaler, matrix komponenter og ressourcer, eller konkurrere om plads og næringsstoffer ved hjælp af toksiner og antibiotika. Bacillus subtilis er en jord bolig og rod-koloniserer bakterie, der udvikler meget organiseret biofilm samfund 14. Analogt til socialinsekter, B. subtilis celler ansætte en arbejdsdeling strategi, udvikling subpopulationer af ekstracellulære matrix producenter og kannibaler, motile celler, hvilende sporer og andre celletyper 15,16. Differentieringen proces er dynamisk og kan ændres ved miljøforhold 17,18.
Strategier overflade kolonisering af bakterier let kan manipuleres under laboratorieforhold ved modifikation af agar koncentration i vækstmediet. Ved lave agar niveauer (0,2-0,3%), bakterier huser aktive flageller er i stand til at svømme, mens halvfast agar (0,7-1% agar) letter flagel drevet samfund breder, kaldet sværmer 19-21. I fravær af flagel, visse bakteriestammer er i stand at bevæge sig over halvfast medium via glidende, dvs. vækst afhængig befolkning ekspansion lettes af exopolysaccharid matrix og andre udskilte hydrofobin forbindelserne 22-24. Endelig bakterier, som er capable af biofilm udvikling danner arkitektonisk komplekse kolonier på hårdt agarmedium (1,2-2%) 14,17,25. Mens disse træk undersøges i laboratoriet ved at justere betingelserne, i naturlige habitater disse overfladeaktive sprede strategier kan transit gradvist fra den ene til den anden, afhængigt af de miljømæssige forhold 26. Mens enkelt celle baseret motilitet er kritisk under initiering af biofilm udvikling ved luft-væske-grænsefladen i både Gram-positive og -negative bakterier 27, komplekse koloni biofilm af B. subtilis påvirkes ikke af sletning af flagellært motilitet 28. Men rumlige organisation under udviklingen af B. subtilis-kolonier biofilm afhænger af densiteten af det bakterielle inokulum anvendes til at initiere biofilmen 8.
Her bruger vi B. subtilis at vise, at rumlig adskillelse under overfladen kolonisering afhænger af mekanismen for populationsniveau motility (dvs. myldrende eller glidende), og koloni biofilm udvikling afhænger af grundlæggeren celletæthed. Vi præsenterer et fluorescerende mikroskopi værktøj, der kan anvendes til løbende at overvåge mikrobiel biofilm vækst, overflade kolonisering og sortiment på makro skala. Endvidere er en kvantificering metode præsenteret at bestemme den relative stamme overflod i befolkningen.
Tilgængeligheden af en fluorescerende værktøjskasse for bakterier letter ikke blot studiet af heterogene genekspression 30,31 og proteinlokalisering 32, men også analysen af rumlige fordeling af stammer inden for en population 8. Fluorescerende markører med tilstrækkelig forskellige excitations- og emissionsbølgelængder muligt at tydeligt lokalisere to stammer, som ellers ikke kan skelnes fra hinanden, når de blandes. Den beskrevne protokol kan anvendes til at observere populationsdynamik i blandede kulturer, fx konkurrence- eksperimenter eller synergi mellem stammer eller arter. Evnen til at bestemme de relative mængder af fluorescens-mærkede stammer i en blandet population er ikke begrænset til overfladen bundet sværmning, skydedøre, eller biofilm kolonier, men kan også anvendes til andre multicellulære biofilm, herunder neddykket, flow celle eller luft-medium-grænsefladen biofilm 27,33-35.
_content "> Mens præsenterede teknik er et kraftfuldt værktøj til at detektere rumlige fordeling af stammer og design konkurrence- eksperimenter, det giver også mulighed følgende genekspression heterogenitet i ekspanderende kolonier. De dyrkningsbetingelser beskrevet her gælder for B. subtilis og de nøjagtige parametre for ekspansion på agar medier kan kræve optimering for andre arter eller stammer 20. Placering af prøverne i en inkubation kammer mens imaging tillader forsøgslederen at følge bestandsudviklingen i tid, selv om der bør lægges vægt på luftfugtighed i kammeret under inkubationen.De her beskrevne teknikker kræver også den genetiske modifikation af de undersøgte bakteriestammer, så stammerne udtrykker fluorescerende markører, som kan skelnes fra hinanden. Desuden udover at have særskilte excitations- og emissionsspektre, anbefales det, at de to valgte fluorescerende markører har lignende kvantum udbytter (dvs. forholdet mellem absorberede fotoner, der udsendes) og kommer til udtryk i et sammenligneligt niveau. Desuden kan relative ændringer intensitet i tid måles og normaliseres til et tidligt tidspunkt-punkt i et eksperiment. Den relative stigning eller fald kan derefter sammenlignet mellem forskellige fluoroforer med forskellige kvante effektivitet. For det præsenterede eksperimentelle system blev forskellige grøn- og rød-fluorescerende proteiner tidligere testet 36,37 for at vælge de mest optimale fluorescerende par, der kan påvises i B. subtilis. bør bestemmes optimale eksponeringstid for hver fluorescerende protein og prøve. Visse celledensiteter eller multiple lag af celler kan være nødvendigt at registrere signalet effektivt i befolkningen. Visse fluorescerende proteiner kan have lave intensiteter i de bakterielle celler som følge ineffektiv ekspression og / eller translation af proteinet og dermed lave udbytte kvante. Sådanne ineffektive fluorescerende markører kunne reduce følsomheden af systemet og forlænge den nødvendige tid til at detektere bakteriestammerne eventuelt resulterer i cytotoksicitet ved excitationslyset. De fluorescerende intensiteter kan derfor ændres ved at ændre promotoren bruges til at udtrykke den fluorescerende reporter kodning gen. Et udtryk, der er for høj kan resultere i unødvendig overproduktion af det fluorescerende protein, der fører til skadelige fitness omkostninger for bakterien. Ved udførelse konkurrenceeksperimenter, bør man overveje omkostningerne ved særlig fluorescerende protein produktion i cellerne. Kontrol eksperimenter, hvor de fluorescerende markører byttes mellem konkurrerede stammer eller hvor to isogene stammer kun afviger i deres fluorescerende markører konkurrerede mod hinanden, er altid forpligtet til at bestemme nogen bias i retning af en markør. Levetider af de fluorescerende proteiner i cellerne kan også påvirke den målte intensitet. Derudover autofluorescens af visse bakterielle species kan kræve anvendelsen af forskellige andre end beskrevet her fluorescerende markører.
Præcist at afgøre de rumlige fordelinger og mængderne af de forskellige bakteriestammer, bør baggrunden signalet hidrørende fra det første fluorescerende protein under brug af fluorescens filter til den anden fluorescerende markør og omvendt individuelt testet på monokultur prøver (indeholdende bakterier producerer kun én markør ). Dette tillader subtraktion af overlappende fluorescerende signalintensiteter. Vigtigere er det, som stereomikroskop registrerer fluorescenssignalet fra oven den ekspanderende koloni, det præsenterede protokol er bekvemt at bestemme den rumlige arrangement i to dimensioner. Arkitekturen i den ekspanderende bakterielle population kan resultere i varierende fluorescens niveauer (dvs. rynke-lignende strukturer kan indeholde flere celler, som viser højere lokale fluorescensintensiteter). Derfor er den beskrevne analyse af billederne determines den rumlige fordeling, men ikke den overflod af stammerne inden for en bestemt placering. Tidligere protokoller beskrev prøveforberedelse for myldrer 20 eller fluorescens billeddannelse af populationsdynamik i bakteriekolonier 38, men vores protokol kombinerer disse teknikker. Andre mikroskopi teknikker, der tillader observation af tredimensionelle opløsning af befolkningen struktur (f.eks konfokal laserscanning mikroskopi 39,40 eller struktureret belysning mikroskopi 41) kan anvendes til prøver med øgede strukturelle kompleksiteter. Disse yderligere teknikker understøtter også enkelt celle baseret detektion af stammerne 31, der ikke er tilgængelige ved hjælp stereomikroskoper.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af tilskud KO4741 / 3-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Endvidere blev laboratorium Á.TK støttes af en Marie Skłodowska Curie karriere integration tilskud (PheHetBacBiofilm) og tilskud KO4741 / 2-1 fra DFG. TH, AD, RG-M., Og EM blev støttet af International Max Planck Research School, Alexander von Humboldt fundament, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia-tyske Academic Exchange Service (CONACYT-DAAD), og JSMC stipendier, hhv.
Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
KCl | any | NA | |
MgSO4 7H2O | any | NA | |
Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
MnCl24H2O | any | NA | |
FeSO4 | any | NA | |
D-Glucose | any | NA | |
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d=66 mm |
Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1000 mm |
Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3mm x 2000mm |
Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63x |
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
Softwares | |||
Image J | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |