This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Opprettholde anlegget seksjon integritet er avgjørende for å studere detaljerte anatomiske strukturer på celle, vev, eller enda organ nivå. Men noen planteceller har stive cellevegger, tøffe fiber og krystaller (kalsiumoksalat, silika, etc.), og høyt vanninnhold som ofte forstyrrer vev integritet under plantevev snitting.
Denne studien etablerer en enkel Hybrid-Cut vev seksjonering metode. Denne protokollen modifiserer en parafinbasert seksjonering teknikk og forbedrer integriteten av vevssnitt fra forskjellige planter. Plantemateriale ble dyppet i parafin før seksjonering i en cryostat ved -16 ° C. Seksjonering ved lav temperatur forherdet parafinblokker, redusert rivende og skrape, og vev integritet vesentlig forbedret. Denne protokollen ble vellykket anvendt til kalsium oksalat-rik Phalaenopsis orkide vev samt gjenstridige vev som reproduksjons organs og blader av ris, mais og hvete. I tillegg kan den høye kvaliteten på vevssnitt fra hybrid-Cut anvendes i kombinasjon med in situ-hybridisering (ISH) for å tilveiebringe romlige uttrykk mønstre av gener av interesse. Som konklusjon, er denne protokollen spesielt nyttig for gjenstridige plantevev inneholdende høye krystall eller silikainnhold. God kvalitet vevssnitt aktiver morfologiske og andre biologiske studier.
Parafinbasert seksjonering metoden er en utbredt teknikk for anatomiske studier. Bevaring av intakt vev anatomi er viktig for morfologiske og biologiske studier. Den parafin-embedded seksjonering teknikk er en fordel fordi parafin-embedding beholder celler og vev morfologi. I tillegg kan parafinblokker lagres hensiktsmessig i lange perioder av gangen. Imidlertid er parafin-innleiret snitte ikke egnet for plantemateriale som inneholder intracellulære krystaller. Krystaller i cellene ofte rive parafin bånd og vevsskade integritet under seksjonering.
I motsetning til parafin seksjonering, er cryosectioning relativt rask og deler kan skaffes uten fiksering, serie dehydrering eller innstøpningsmediet infiltrasjon en. Frysesnitt er kompatibel med mange programmer som immunhistokjemi, in-situ hybridisering, og enzymet histokjemi. Den andre fordelen av cryosectioning erat denne metoden ikke går gjennom en potensiell denaturering prosesser som høy temperatur og kjemiske behandlinger, er så cellulære molekyler godt bevart innenfor vev seksjoner 2. Cryosectioning er generelt foretrukket fremfor parafin-baserte seksjonering for studier i animalsk vev. Imidlertid er cryosectioning ikke det første valget i planter fordi kuldegrader noen ganger dannes iskrystaller som påvirker kvaliteten av § integritet. Selv om osmoregulering slik som sukrose oppløsninger, polyetylenglykol (PEG), eller glycerol-3 har blitt rapportert å redusere krystall is formasjon under frysebetingelser, er forbedringen mindre enn optimal.
For å tilpasse til forskjellige miljøer, forskjellige planter har ofte forskjellige vev tekstur og planteceller har utviklet seg til å danne stive cellevegger, harde fibre, og krystaller 4,5. For eksempel, uløselige kalsium oksalat krystaller og silika kropper er ganske vanlig iplanter 6. Silikat organer / krystaller har blitt rapportert å opprettholde anlegget arkitektur, erectness, og forebygge sykdom eller skadedyr i kornplanter 7-9.
Rote orkideer og cut-blomsten orkide markedet er blomstrende, og det er en voksende industri. Phalaenopsis Aphrodite (Orkide) er en av de viktigste eksportprydplanter i Taiwan. Betydelig innsats har blitt gjort for å forstå de morfologiske og fysiologiske endringer av blomstrende prosesser i Phalaenopsis orkideer. Blomster pigger av Phalaenopsis orkideer er initiert fra axillaris knopper på bladet basen. Etter en periode med kjølig romtemperatur (ca en og en halv måned), axillary knopper forstørre, bryte dvalen, og stikker fra bladet base for å utvikle seg til små blomster pigger. For å forstå de fysiologiske, cellulære og molekylære prosesser av pigg initiering, er det viktig å utvikle en robust anatomisk teknikk for å visuaLize vev eller markører på en riktig måte. Men tilstedeværelsen av allestedsnærværende krystaller i orkideer vev, særlig i aksillære knopper, gjør anatomisk arbeidet vanskelig.
Her forsøkte vi å forbedre seksjon integritet gjenstridige plantemateriale som har blitt hittil ansett som teknisk utfordrende. Her viser vi en forbedret protokoll kalt Hybrid-Cut. Det er en parafin-basert snitte metode som utføres ved hjelp av en kryostat. Parafin embedding løser høyt vanninnhold i plantevevet. Seksjonering ved lav temperatur stivner parafinblokken, reduserer krystall rive problem, og forbedrer vev integritet betydelig. Denne protokollen forbedrer vev integritet for gjenstridige planteprøver.
Planteceller har stive cellevegger, tøffe fiber, krystaller og høyt vanninnhold som forårsaker vev rivende problemer under plantevev snitting. Selv om parafin-baserte seksjonering er ofte brukt for plantevev, de endogene krystallene ofte rift i plantevevet under snitting (figur 1). På grunn av den iboende høye vanninnholdet i plantecellene, fører kryostat-baserte snitte ofte ødelagte celler og seksjoner sprakk vev.
I denne studien ble det en kombinert parafin-embedding og cryosection protokoll kalt Hybrid-Cut utviklet og god kvalitet vevssnitt ble oppnådd. Denne protokollen løser problemet forbundet med høyt vanninnhold ved å innføre parafin innebygging, og reduserer den rivende virkning ved herding parafinvoks ved lav temperatur under snitting (figur 3). Derfor er denne modifiserte protokollen fordelaktig i enten parafin-baserte seksjonning eller cryosectioning for å bevare anlegget vev integritet.
Dette manuskriptet viser at hybrid-Cut metoden bevarer vevet integritet i mange vev av Phalaenopsis orkide som aksillær knopp, frø, og PLB, etc. som inneholder høye nivåer av krystaller (Tall 3-4). Dessuten er denne protokollen mottakelig for kornavlinger slik som reproduktive organer og blader av ris, mais og hvete som inneholder høysilika (figurene 5-6). Antagelig kan denne protokollen brukes på treaktige planter som inneholder høy fiber.
Generelt er fikse vev grundig svært viktig for hybrid-Cut. Vi har funnet at formaldehyd-alkohol-eddiksyre (FAA) fikser er bedre enn PFA å bevare integriteten av vev noen gjenstridige vev som aksialt knopper, røtter, etc. Imidlertid, PFA fungerer bedre enn FAA for å bevare RNA integritet. Derfor PFA anbefales å fikseprøve for in situ hybridisering (ISH) arbeid. Protokollen er beskrevet her er beregnet for RNA ISH eksperiment. Derfor ble alle reagenser fremstilt for å unngå RNA-degradering ved å eliminere forurensning av RNase DEPC behandling. Hvis Hybrid-Cut delen er for anatomiske studier, vanlig omvendt osmose (RO) vann og dens avledede buffer eller reagenser er akseptabelt.
Reduserende prøvestørrelse og tykkelse til mindre enn 3 mm er nyttig for infiltrering. Videre øker nedsenkningstiden for dehydrering og infiltrasjon er nødvendige for hard tekstur vev. Begrensning av denne protokollen kan skyldes problemer forårsaket av utilstrekkelig fiksering, dehydrering, og infiltrasjon av prøven. Derfor, er justering av behandlingstiden for hvert trinn kritiske for å frembringe god kvalitet parafin blokken. Normalt trenger hardere vev lengre saksbehandlingstid enn mykere vev.
I tillegg viste vi at Hybrid-Cut jobbet med hell i kombinasjon with ISH for å gi romlig fordeling av de valgte transkripter (figur 7). I sammendrag, er denne protokollen nyttig for studier av anlegget anatomi og gir en vev-spesifikk RNA kart over de valgte gener. I tillegg kan den anvendes på andre molekylære studier slik som terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick ende merking (TUNEL) assay, fluorescens in situ hybridisering (FISH), og immunfarging teknikker. Som konklusjon, er dette forbedret vev seksjonering protokoll både nyttig og nyttig for forskere i plantesamfunn.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |