Method Article

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과 체외 예방 효과

DOI:

10.3791/54767

⸱

August 23rd, 2016

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

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지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Abstract

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Zika 바이러스 (ZIKV)는 같은 소두증, 눈 결함 및 손상 성장으로 태아의 발달 이상에 연결되어 신흥 병원균이다. ZIKV는 플라 비비 리다 가족의 RNA 바이러스이다. ZIKV 주로 모기 전송뿐만 아니라 태아 수직 전송뿐만 아니라 성적 접촉을 모체로 확산 될 수있다. 현재까지 바이러스에 감염된 사람들을 보호하기 위해 가능한 신뢰할 수있는 치료 또는 예방 접종 옵션이 없습니다. 재현 효과 Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템의 개발 ZIKV 복제뿐만 아니라 약물과 백신 개발의 분자 메커니즘을 연구하는데 중요하다. 이와 관련하여, 바이러스의 생산 및 성장 분석을 위해 포유 동물 세포 기반 체외 Zika 바이러스 배양 시스템을 설명하기위한 프로토콜은 여기에보고된다. 바이러스 역가를 측정하는 세포 단층과 상패 분석​​에 Zika 바이러스에 의한 플라크의 형성에 대한 세부 사항이 표시됩니다. 바이러스 게놈 복제 속도론및 이중 가닥 RNA 게놈 replicatory 중간체가 결정된다. 이 문화 플랫폼은 인터페론 α (IFN-α)의 식별 결과 사이토 카인의 작은 세트의 라이브러리에 대해 화면으로 사용하고, IFN-β와 Zika 바이러스 성장의 강력한 억제제로 IFN-γ. 요약하면, 시험 관내 감염 Zika 바이러스 배양 시스템 및 각종 바이러스 학적 분석은 크게 더 바이러스 발병의 메커니즘과 바이러스 독성의 진화를 해명의 연구 커뮤니티에 도움이 할 수있는 잠재력을 가지고 본 연구에서 입증된다. 바이러스 IFN 알파는 또한 감염된 임산부 포함 고위험 인구 Zika 바이러스 감염에 대한 예방제, 노광 후 예방 및 치료 방법으로 평가 될 수있다.

Introduction

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Zika 바이러스 (ZIKV)는 소두증와 가난한 임신 1,4를 성과와 관련된 중요한 인간 병원체이다. ZIKV는 같은 뎅기열, 웨스트 나일, 세인트 루이스 뇌염 바이러스와 같은 신경 학적 결함을 일으킬 수 의학적으로 관련 플라 비 바이러스의 집합에 속한다. 바이러스 전송의 주요 모드뿐만 아니라, 성적 전송은 5,6를보고되었습니다, 모기 벡터 Aedes aegypti에 의해, 그리고. ZIKV 인해 모기 벡터의 확대 지리적 분포 및 출생 결함과의 강한 상관 관계에 주요 글로벌 건강 문제가되고있다. ZIKV 먼저 Zika 숲에서 감시 붉은 털 원숭이에서 1947 년 고립 된, 우간다 및 제 인간의 경우는 1952 7,8보고되었다. 발열, 발진, 두통, 결막염, 근육 / 관절 통증 등의 가벼운 증상에 존재 ZIKV에 감염 될 개인. 감염된 임산부는 태아 1 ZIKV를 전송할 수 있습니다. 지IKV 감염은 길랑 바레 증후군, 말초 신경의자가 면역 탈수 초 질환 (9)에 연결되어있다.

Zika 바이러스 게놈의 길이는 약 10.8 킬로베이스이고 긍정적 인 의미, 단일 가닥 RNA 분자로 구성되어 있습니다. 게놈의 구조는 단백질 코딩 영역....

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Protocol

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주 : 작업 흐름의 개략적 개요는도 1에 제시된다.

1. 세포

  1. Zika 바이러스 생산 및 바이러스 성 복제주기의 분석을위한 베로 세포를 사용합니다.
  2. 전체 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L- 글루타민, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신을 함유하는 성장 배지 (100 단위 / ml), 및 10 mM의 HEPES를 준비한다.
  3. 5 % CO 2, 37 ℃에서 특정 완료 성장 배지 베로 세포 배양.

2. Zika 바이러스 생산

  1. T-75 플라스크에 0.25 % 트립신을 사용하여 80 %의 세포 밀도의 베로 세포를 수확하고, 세포 수를 계산.
    1. T-75 배양 플라스크에서 미디어를 대기음 2 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세포를 씻어.
    2. 0.25 % 트립신 2 ML을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 플라스크를 품어.
    3. 트립신을 불 활성화하는 성장 매체를 포함하는 혈청의 8 ML을 추가합니다. 피펫 위 SUS 아래로PEND 세포를 15 ㎖의 튜브에 세포를 전송하고.

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Results

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Zika 바이러스 변형, 아시아 유전자형 (PRVABC59 GenBank 액 번호 KU501215)은이 연구 (12)에 이용되었다. 80 % 컨 플루 언시 베로 세포는 새로이 Zika 바이러스 감염을 연구에 사용 하였다. 바이러스 생산과 바이러스 학적 특성화 이후, 초기 통로 (P3) Zika 바이러스를 사용 하였다. 바이러스 플라크를 감염 둘째 날에 관찰되었다. 초기에 감염된 세포로부터 방출 Zika 바이러스 자손은 단층 배양 (도 2)에 보이는 플라크의 형성을 초래할 인접 세포로 확산 할 수있다. Zika 바이러스 감염의 세포 변성 효과 (CPE)는 같은 라운딩 및 분리 세포뿐만 아니라 용균 세포 사멸 등의 형태 학적 변화에 의해 특징입니다.

바이러스 역가를 측정하기 위해, T-160 플라스.......

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Discussion

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여기에, 시험 관내에서 Zika 바이러스를 배양하기위한 간소화 된 프로토콜이 제공됩니다. 바이러스 배양을 확장 역가를 측정하고, 제공 한 게놈 복제를 정량화하기위한 최적의 엔드 포인트를 식별하는 단계를 포함하여 긴급. Zika 바이러스 감염 인자를 처리하는 동안, 바이오 안전성 절차를 엄격하게 따라야한다, 인간 병원체이기 때문에. 원숭이 신장 세포주 베로은 다양한 바이러스 학적 분석을 보여주는 사용 하였다. Zika 바이러스 복제의 반응 속도는 다양한 조직과 종의 세포에서 다를 수 있습니다. 이전 15 바와 같이 추가의 세포주가 사용될 수있다. Zika 바이러스 감염된 태아 (3)의 뇌 조직에서 분리 된 피질 신경 전구 세포를 감염 14 밝혀졌다. 따라서, 신경 세포 ZIKV 감염 병리학을 평가하는 추가 셀 고유 통찰력을 제공 할 수있다. 아프리카와 아시아 유전자형의 neurovirulent 표현형의 차이를 조사 할 수있다이 감염 배.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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지카 바이러스 균주 PRVABC59 제공해 주신 미국 질병통제예방센터(CDC)의 Aaron Brault 박사와 Brandy Russell 박사에게 감사드립니다. 이 원고를 카피 에디팅해 준 예일 대학교의 니콜라스 텐(Nicholas Ten)에게 감사한다. 이 연구는 V.A.에 수여하는 Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning25-054-C1
Trypan 블루 스테인 0.4%Life TechnologiesT10282
백작 부인 – 자동 세포 계수기ThermoFisher ScientificC10227
백작 세포 계수  챔버 슬라이드ThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
마우스 단클론 항dsRNA 항체 J2 영어 & 과학 컨설팅 Kft.
염소 안티-토끼 IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR 시스템Thermo Fischer4471088
RNase-Free DNasePromegaM6101
Vero Cell Line ATCCCCL-81
지카 바이러스 균주 PRVABC59Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6Peprotech200-06                         
IL-1 알파             페프로텍200-01A                   
TNF-알파페프로텍300-01A                   
인터페론 알파 A   R & D Systems11100-1
인터페론 베타Peprotech300-02BC
인터페론 감마Peprotech300-02
원심분리기 5415REppendorf5415R
원심분리기 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti 면역형광 현미경 Nikon Intenselight C-HGFINikon방문 Nikon 요청
10010200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al.....

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Zika VirusInfectious Cell CultureViral Titer AssayPlaque FormationGenome ReplicationInterferon TreatmentCytokine ScreeningVero CellsImmunocytochemistryRT qPCR

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