이 원고는 돌연변이를 thermostabilizing을 선별 인간의 세로토닌 수송을 정화, 높은 친 화성 항체를 생성하고, 항우울제 약물 S의 시탈 로프 람 바인딩 세로토닌 수송 – 항체 복합체를 결정화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 도전 막 수송 수용체와 채널들의 연구에 적용 할 수있다.
세로토닌 전달체는 세포로 세포 세로토닌 "펌프"는 나트륨과 염소 결합 수송된다. S의 시탈 로프 람은 세로토닌 재 흡수를 차단하는 고 친화력 세로토닌 운반체에 결합함으로써 우울증 및 불안증의 치료에 사용되는 약물이다. 여기에서 우리는 효율적인 절차 및 명시 적, 안정 정화 및 S의 시탈 로프 람과 다른 항우울제에 결합 세로토닌 수송 – 항체 복합체를 구체화 할 수있는 도구 세트를보고한다. 세로토닌 전달체를 안정화 돌연변이는 결합 분석을 S – 시탈 로프 람을 사용하여 확인 하였다. 배큘로 바이러스 – 형질 감염된 HEK293S GnTI 발현 세로토닌 운반자 – 세포로 재구성 테오 높은 친 화성 항체를 발생하기 위해 사용되었다. 우리는 구조 연구를위한 유용한 항체를 발견하는 전략을 개발했습니다. Sf9 세포에서의 항체 단편의 발현을위한 직접적인 방법은 확립되어있다.이 절차를 사용하여 정제 수송 – 항체 복합체는 잘 행동하고 쉽게 3-4 Å 해상도에 X 선을 회절 S의 시탈 로프 람과 복합체를 생산, 결정화입니다. 여기서 개발 된 전략은 다른 도전 막 단백질의 구조를 결정하는데 이용 될 수있다.
세로토닌 운반체 (SERT)는 세포막에 걸쳐 1 세로토닌의 수송을 용이하게하는 세포막 단백질이다. SERT 또한 도파민과 노르 에피네프린 수송 (2) 신경 전달 물질 나트륨 Symporters (NSSS)의 가족에 속한다. 세로토닌 SERT 경쟁적 수송층 (3)을 억제하는 작용을 널리 처방 우울 및 항 불안 약물의 분자 표적이다. SERT는 시냅스 틈새에서 신경 전달 물질을 제거하는 나트륨의 에너지 적으로 유리한 cotransport을 이용한다. 세로토닌 시스템의 광범위한 특성은 세로토닌 대사의 변화가 거의 기분, 수면, 통증,인지 등 모든 신경 프로세스에 영향을 미칠 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다, 그리고 침략은 4 행동들. SERT 함수 S의 시탈 로프 람과 같은 항우울제 및 선택적 세로토닌 재 흡수 억제제 (SSRI는)의 사용을 통해뿐만 아니라 psychostimula 의해 변형 될 수있다국세청 및 암페타민과 3,4- 메틸렌 디 옥시 N의 -methylamphetamine 또는 "엑스터시"1, 2 등의 중독의 약물.
SSRI는 기분 장애의 치료에 대단히 중요하다, 그러나 자신의 행동에 대한 정확한 구조적으로는 잘 이해되지 않습니다. WT SERT 따라서 SERT 5,6의 3 차원 구조의 진전을 저해 세제 미셀 불안정하다. 최근에는 세제의 넓은 범위에서 견고하게 안정하고 활성 6 바인딩 SSRI 유지 SERT의 변이체를 개발 하였다. 이 내열성 SERT의 변형은 섬광 근접 기반의 열 안정성 분석을 이용하여 선정되었다. 여기에서 우리는 항체 및 S의 시탈 로프 람 복잡한에, SERT을 결합 할 수있는 높은 친 화성 항체의 생성을위한 절차 및 내열성 SERT의 정제 및 결정화에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 SERT 및 8B6 유전자가 성공적인 된 것으로 가정Y는 각각 BacMam 7 및 곤충 발현 벡터에 클로닝. 항체를 생성하려면, cDNA를 코딩하는 잔류 WT SERT의 73-616은 C 말단 연쇄상 구균 II 태그 (SERT IC)와 BacMam 벡터에 클로닝 하였다. 열 안정성 화면 들어 SERT 잔기 C 말단 GFP와 73-616, 패 혈성 II 및 10 그의 태그 (SERT의 TC)를 사용 하였다. 개별 점 돌연변이는 SERT TC 배경에서 발생했다. 결정화 프로토콜의 경우, SERT-GFP 융합 단백질 표면 시스테인 C554A, C580A의 열 안정성 돌연변이, Y110A, I291A, 및 T439S 돌연변이를 들고, 트윈 연쇄상 구균 [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] 10-그의 태그 사용 및 C622A (SERT의 CC). 트롬빈 절단 서열 (LVPRGS)도 N- 제거 및 C 말단을 허용 Q76 및 T618 후 SERT의 CC에 삽입 하였다. 8B6 팹을 코딩하는 플라스미드는 무거운 빛을 모두 표현하기 위해 설계되었다두 개의 별도의 폴리 헤드린 프로모터의 조절하에 GP67 분비 서열과 항체의 사슬. 8B6 항체의 중쇄의 C- 말단 8 His 태그를 태그로하고, 트롬빈 절단 부위는 중쇄 및 태그 사이에 삽입 하였다.
생물 리 학적 기술에 의해 세포막 단백질 구조의 결정은 많은 심각한 의학적 수송 수용체 및 채널 (11) 발굴 사업 남아있다. 여기에서 우리는 S의 시탈 로프 람 바인딩 인간의 세로토닌 수송 체의 구조 결정을 위해 개발 된 상세한 전문 지식을 공유 할 수 있습니다. 우리는 이러한 방법은 다른 구조적 상태뿐만 아니라 다른 어려운 막 단백질의 구조에 SERT의 구조를 결정하기 유용 할 것으로 기대. 또한, 여기에 설명 된 기술들은 생화학 세제 정제 SERT 및 가까운 천연 지질 환경의 기능을 연구하는데 사용될 수있다.
SERT 결정화 여러 도구와 방법의 개발에 힌지. 첫째, 수송 열 안정성 개선은 막 6에서 수송의 추출 다음과 같은 다양한 세제 미셀에 잘 행동했다 SERT의 변종을 생산했다. 둘째, 사용정제 및 결정화에 걸쳐 높은 친 화성 리간드 S의 시탈 로프 람 더욱 향상된 안정성 및 감소 된 구조적 이질성. 셋째, 접종 결정화 양을 용이하게 이주 단기간에 SERT 대량 생산에 허용 BacMam 발현 시스템 (7)의 발전. 마지막으로, 전략의 개발이 결정에 SERT – 항체 복합체의 잘 정렬 된 포장을 촉진 8B6 항체의 발견 허용 3D 에피토프를 인식 높은 친 화성 항체를 선택합니다.
종종 프로토콜에 걸쳐 발생할 중요한 단계 및 시약뿐만 아니라 공통의 문제점이있다. 먼저, 높은 역가 SERT P2 바이러스의 발생이 문제가 될 수있다. 이 프로토콜에 기재된 P2 바이러스를 생성 P1 바이러스의 낮은 농도를 추가하는 것은 일반적으로 이러한 문제를 완화하고, P2 바이러스 역가가 낮은 경우에, P3 바이러스 날기하게 할 수있다0.0001의 MOI에서 g 바이러스. 1 × 10 8 바이러스 입자 미만의 역가와 바이러스 / mL를 사용할 수 없습니다 거의 항상 낮은 단백질 수율가 발생합니다. 표현의 경우, 감염된 HEK293S GnTI은 – 그들은 N 복잡한 N의 -glycans를 합성 할 수 없습니다, 따라서 내가 활동을 -acetylglucosaminyltransferase 및 부족하기 때문에 세포 대신 만 높은 만노스의 N의 -glycans 생산, 선택되었다. EndoH의 절단은 N은 아스파라긴에 부착 된 N의 -acetylglucosamine을 떠나, 세포 외 루프 2 (EL2)의 두 사이트에서 높은 만노스 글리 칸의 글리코 실화를 -linked. N의 소화는 설탕이 결정화 가능성이 중요하다 EL2의 표면 엔트로피를 감소 -linked. 항체의 생성을 위해 상기 IC SERT 예방 접종에 사용되어야한다. GFP 12 고도로 면역 원성이고 완전히 SEC에 의해 제거하는 것이 곤란하기 때문에 항체를 생성하는 융합 태그로서 사용되어서는 안된다. SERT의가요 N- 및 C- 말단은 없었다이들 영역에 대한 항체를 방지하기 위해 구조물에 포함. 마우스는 재구성 된 단백질의 30 μg의와 예방 접종을 할 수있다; 항체의 높은 혈청 농도를 검출 할 수있을 때까지 면역화 된 마우스를 계속 설명 (13) 하이 브리 도마 세포를 생성한다. thermostabilized 구조는 일반적으로 예방 접종을위한 최선의 선택; 반송 장치가 바르게 행동이며, 정제 다음의 생물학적 활성을 유지한다면, 이것은 종종 항체를 발생하기에 충분하다. 8B6 항체는 WT SERT에 대해 제기되었다. 결정화, FSEC 판단으로 단 분산 복합체를 함유 SEC 만 피크 분획을 합치고 농축한다. SERT-8B6 결정은 조건의 좁은 범위에서 성장하고 구체적으로 SERT의 결정 성장과 관련된 문제를 해결하기 위해주의해야 단계가 있습니다. HCl로 조정 트리스 염기의 버퍼가 결정 성장을 지원하지 않기 때문에, 저류 액에 사용되어서는 안된다; 그것은 따라서 CRI입니다광 케이블 (optical) 대신 NaOH로 조정 트리스를 사용합니다. 결정이 성장하지 않거나 많은 작은 결정이 관찰되면, PEG 400 농도도 작은 증감이 의뢰 될 것인지 결정하도록 SERT은 PEG 400의 좁은 농도 범위로 성장한다. 또한, 첨가제 -6- 아미노 헥산 산 또한 핵을 향상시키기 위해 최적화 된 스크린에 사용되었다. 단백질의 감소 비율 : 웰 용액은 결정 성장 인자를 결정하는 핵심이다. 일반적으로 큰 3 차원 결정의 성장을 지원하는 1 : 2에 가까운 드롭 비율로, 권장 1 : 2-1.5의 비율을 삭제합니다. 마지막으로, 낮은 프로파일 24- 웰 플레이트의 사용은 아마도 때문에 증기의 확산 속도 수정을 또한 결정 성장 방향으로 중요하다.
인민 방법으로 다른 방법이 시험 5를 결합하는 필터를 사용하여 코카인 – 결합 된 형태로 래트 세로토닌 전달체를 안정화 변이체 스크리닝하기 위해 개발되었다. 대조적으로, SPA 바SED 분석은 리간드에 결합 남아 SERT의 비율의 결정에 의해 다음과 같은 순서 가열 단계 수 있습니다. 따라서,이 샘플의 소수의 용융 온도의 신속한 측정을 허용한다. 스파 방법은 방사성 표지 높은 친 화성 리간드의 가용성에 의존하고 더 리간드가 submicromolar 선호도와 결합되는 알려져 있지 않은 경우 다음 다른 방법이 필요합니다. 많은 다른 방법이 일반적으로 형광 염료 및 열량 (14)의 결합으로 단백질 안정성을 측정하는 데 사용되어 있지만 낮은 처리량을 직접 측정 기능 또는 단백질을 다량 필요로하거나없는된다. SPA에 법을 사용할 수없는 경우, 하나의 대안 높은 처리량 방법은 샘플을 수송 잔여 분획을 분리 하였다 가열 FSEC 계 열 안정성 분석 15 (FSEC-TS)이다. FSEC-TS는 크로마토 동작 및 올리고머 상태에 액세스하기위한 유용한 방법이며 AP 인인민 방법과 함께 사용할 수 있습니다 owerful 보완적인 도구입니다.
다양한 일반적인 단백질 발현 시스템의 비교도 SERT 식 (16)에 대한 포유 동물 세포의 사용을 선호하는 것으로하고, 당연히이 가능성 포유류 기원의 다양한 단백질에 대한 경우이다. 우리는 표현을 위해 사용한 방법은 SERT에 맞게 조정하지만 가능성이 쉽게 적응할 수있다. 발현의 높은 수준을 선호하는 조건은 신중 나트륨 부티레이트 히스톤 데 아세틸 라제 억제제의 발현 온도 바이러스 농도, 및 현재의 시간 변화에 의해 식별되어야한다.
우리는 일반적으로 이전 바인딩 높은 친 화성 리간드를 유지하기 위해 재구성하는 CHS와 함께 같은 C12M 같은 가벼운 긴 사슬 세제의 선호도 정화를 선호. 소수성 흡수를 사용하여 재구성은 우리가 여러 가지 다른 운송 및 수용체에 대한 효과적인 것으로 나타났습니다 가벼운 기술이다. 이 경우투석, 희석, 또는 SEC에 의해 높은 임계 미셀 농도 세제의 제거 (17)가 항원은 세제 충분히 안정 제공 성공적으로 이용 될 수 없습니다. 더 적합한 항체가 발견되지 않는 경우에, 우리는 거의 항상 문제가 기능 또는 항원의 변성의 손실에 기인하며 이러한 경우 우리가 성공적으로 단백질의 생화학에 특별한주의를 지불하는 새로운 예방 접종을 실시 찾을 수 있습니다. 마지막으로 높은 친화 도로 결합 리간드 및 항체를 합리적으로 계획된 정석 실험을위한 기초를 형성해야하며, 내열성 변형을 이용하여, 하나는 다른 계면 활성제의 성질을 변화시킴으로써 조건의 넓은 범위를 선별 할 수있다. 또한, 지질 메소 18 bicelles 결정화 또는 19을 사용하여 항상 미셀 결정화 대안으로 고려되어야한다.
이러한 원리 및 방법은 약간의 후 변형과 함께 사용될 수있다표현하고 다른 표현 호스트에서 정화, 높은 친 화성 약물의 표적의 구조 결정에 특히 유용하기 어려운 다른 많은 횡단 단백질 양이온.
The authors have nothing to disclose.
We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
IPTG | Anatrace | I1003 | |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
SF9 | ATCC | CRL-1711 | |
Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 0984018DJ | |
Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
Leupeptin | Sigma | L2884 | |
Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
Aprotinin | Sigma | A1153 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
Asolectin | Sigma | 11145 | |
Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
Lipid A | Sigma | L5399 | |
Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary for western blotting |
Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
Serotonin | Sigma | H9523 | |
pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
Imidazole | Sigma | 56749 | |
n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris used for preparation of crystallization reservoirs |
PEG 400 | Sigma | 91893 | |
6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
1 L filter system | Corning | 430517 | |
2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
Extruder | Northern Lipids | ||
Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
HPLC | Shimadzu | 51476 | |
Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
1 ml HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
Sertraline | Sigma | S6319 |