Detta manuskript beskriver hur man screena för thermostabilizing mutationer, rena mänskliga serotonintransportören, generera antikroppar med hög affinitet, och kristallisera serotonintransportören-antikroppskomplex bundet till det antidepressiva läkemedlet S -citalopram. Detta protokoll kan anpassas till studier av andra utmanande membrantransportörer, receptorer, och kanaler.
Serotonintransportören är en natrium och klorid kopplade transportör som "pumpar" extracellulärt serotonin in i celler. S -citalopram är ett läkemedel som används för behandling av depression och ångest genom att binda till serotonintransportören med hög affinitet, blockerar serotoninåterupptags. Här rapporterar vi ett effektivt förfarande och en uppsättning verktyg för att stabilisera, Express, renar och kristalliserar serotonintransportören-antikroppskomplex bundna till S -citalopram och andra antidepressiva läkemedel. Mutationer som stabiliserar serotonintransportören identifierades med användning av en S -citalopram bindningsanalysen. Serotonintransportör uttryckt i baculovirus-transducerade HEK293S GnTI – celler, rekonstituerades in i proteoliposomer och används för att höja antikroppar med hög affinitet. Vi har utvecklat en strategi för att upptäcka antikroppar som är användbara för strukturstudier. En enkel metod för expression av antikroppsfragment i Sf9-celler har också etablerats.Transporter-antikroppskomplex som renats med hjälp av detta förfarande är väluppfostrade och lätt kristalliserar, vilket ger komplex med S -citalopram som avböja röntgen till 3-4 Å upplösning. De strategier som utvecklats här kan användas för att bestämma strukturen av andra utmanande membranproteiner.
Serotonintransportören (Sert) är en integrerad membranprotein som underlättar transporten av serotonin över cellmembran 1. Sert tillhör en familj av Neuro Sodium Symporters (NSSS) som också innehåller dopamin och noradrenalin transportörer 2. SERT är det molekylära målet för allmänt föreskrivna antidepressiva och ångestdämpande läkemedel som verkar för att kompetitivt hämma serotonin transporter 3. Sert utnyttjar energiskt gynnsamma cotransport av natrium för att avlägsna signalsubstans från synaptiska klyftan. Omfattande karaktärisering av det serotonerga systemet har visat att förändringar i serotonin metabolism tycks påverka praktiskt taget alla neurologiska processer inklusive humör, sömn, smärta, kognition, och aggression beteenden 4. SERT funktion kan modifieras genom användning av antidepressiva läkemedel och selektiva serotoninåterupptagshämmare (SSRI) som S -citalopram, liksom genom psychostimulaNTS och droger av missbruk, såsom amfetamin och 3,4-metylendioxi- N -methylamphetamine eller "extas" 1,2.
SSRI är oerhört viktiga för behandling av affektiva störningar, men den exakta strukturella basen för deras agerande är inte väl förstådd. WT SERT är instabil i detergentmiceller, vilket hindrar utvecklingen mot ett tredimensionellt (3D) struktur Sert 5,6. Nyligen utvecklade vi varianter av Sert som är kraftigt stabil i ett brett spektrum av tvättmedel och behålla SSRI-bindande aktivitet 6. Dessa termo sert varianter valdes med hjälp av en Scintillation Proximity baserad termoanalys. Här beskriver vi ett förfarande för generering av antikroppar med hög affinitet som kan binda SERT, och rening och kristallisation av termostabilt SERT, i komplex med antikropp och S -citalopram.
Detta protokoll förutsätter att Sert och 8B6 gener har varit framgångsriky klonades in i BacMam 7 och insekts expressionsvektorer, respektive. Att generera antikroppar, ades cDNA som kodar för resterna 73-616 av WT SERT klonades in i BacMam vektor med en C-terminal Strep Il-tag (SERT IC). För termo skärmen var Sert resterna 73-616 med C-terminal GFP, Strep II, och 10-His-taggar (SERT TC) användas. Individuella punktmutationer genererades i Sert TC bakgrunden. För kristallisa protokollet var Sert-GFP-fusionsprotein som används med Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] och 10-his-märkningar, bär termo mutanter, Y110A, I291A och T439S och mutationer av ytan cysteiner C554A, C580A och C622A (SERT CC). Trombin klyvningssekvenser (LVPRGS) var också insatt i SERT CC efter F76 och T618 för att tillåta avlägsnande av den N- och C-terminalerna. Den plasmid som kodar för 8B6 Fab var konstruerad för att uttrycka både tunga och lättakedjor av antikroppen med gp67 utsöndringssekvenser som styrs av två separata polyhedrin-promotorer. C-terminalen av den tunga kedjan av 8B6 antikropp märktes med en 8-His-markör och en trombinklyvningsställe insattes mellan den tunga kedjan och den taggen.
Bestämning av membranproteinstruktur genom biofysiska tekniker fortfarande en skrämmande företag för många medicinskt viktiga transportörer, receptorer, och kanaler 11. Här delar vi detaljerad kunskap som utvecklats för strukturbestämning av den mänskliga serotonintransportören bunden till S -citalopram. Vi räknar med att dessa metoder kommer att vara användbart för att bestämma strukturer av Sert i andra konformationstillstånd samt strukturer för andra svåra membranproteiner. Vidare kan de biokemiska metoder som beskrivs här också användas för att studera funktionen av renat SERT i diskmedel och en nästan infödda lipid miljö.
SERT kristallise gångjärn på utvecklingen av flera verktyg och tekniker. Först, förbättringar i transportören termo producerade sert varianter som hjälpsökande i olika detergentmiceller efter extraktion av transportören från membranen 6. För det andra, användningenav high-affinitetsligand S -citalopram hela rening och kristallisation ytterligare förbättrad stabilitet och minskad konforma heterogenitet. Tredje, utveckling av BacMam expressionssystemet 7 tillåtna för produktion av stora mängder av SERT i en kort period av 2 veckor, vilket underlättar både immunisering och kristallisation. Slutligen, för utvecklingen av strategier för att välja för hög affinitet antikroppar som känner igen 3D-epitoper tillåts för upptäckten av 8B6 antikropp som främjar välordnad förpackning av sert-antikroppskomplex i kristaller.
Det finns ett antal kritiska steg och reagens samt vanliga problem som ofta förekommer i hela protokollet. För det första kan alstringen av hög titer SERT P2-virus vara problematisk. Lägga låga koncentrationer av P1-virus för att generera P2 virus som beskrivs i detta protokoll minskar vanligtvis detta problem, och i de fall där P2 virus titer är låg, kan P3 virus göras using-virus vid en MOI av 0,0001. Virus med en titer mindre än 1 x 10 8 viruspartiklar / ml bör inte användas och kommer nästan alltid att resultera i låga proteinutbyten. För expression, HEK293S GnTI – celler valdes eftersom de saknar N -acetylglucosaminyltransferase I-aktivitet och kan därför inte syntetisera komplexa N-glykaner, istället producerar endast hög mannos N-glykaner. EndoH klyver N-kopplad glykosylering av hög mannos glykaner på två platser i extracellulära slingan 2 (EL2), vilket ger en N -acetylglucosamine fäst vid asparagin. Nedbrytning av N-kopplade socker minskar ytan entropi EL2 som sannolikt viktigt för kristallisation. För genereringen av antikroppar, bör den SERT IC användas för immunisering. GFP är höggradigt immunogent 12 och bör inte användas som ett fusions tagg för att generera antikroppar eftersom det är svårt att helt ta bort genom SEC. Den flexibla N- och C-terminalen av SERT var också inteingår i konstruktionen i syfte att undvika antikroppar mot dessa regioner. Möss kan immuniseras med 30 mikrogram färdigberedd protein; fortsätta immunisering av möss tills höga serumkoncentrationer av antikroppar kan detekteras och producera hybridomceller som beskrivits 13. En thermostabilized konstruktion är oftast det bästa valet för immunisering; om transportören är uppfört sig väl och bibehåller biologisk aktivitet efter rening, är detta ofta tillräckligt för att framkalla antikroppar. Den 8B6 antikropp höjdes mot WT SERT. För kristallisation, bör endast de toppfraktionerna från SEC innehållande monodispersa komplex som bedöms av FSEC kombineras och koncentreras. SERT-8B6 kristaller växa i ett snävt intervall av villkor och det finns ett antal steg som bör vidtas för att felsöka problem specifikt relaterade till SERT kristalltillväxt. Tris-bas justerades med HCl bör inte användas i reservoarlösningen, eftersom denna buffert inte stöder kristalltillväxt; är det således critisk att istället använda Tris justerad med NaOH. SERT kristaller växa i ett smalt koncentrationsintervall av PEG 400, så om kristaller inte växer eller om många små kristaller observeras, skulle även en liten ökning eller minskning i PEG 400 koncentrationen rådas. Vidare har tillsatsen 6-aminohexansyra används också i den optimerade skärmen för att förbättra kärnbildning. Nedgången förhållandet protein: väl lösningen är också en avgörande faktor för kristalltillväxt. Drop-förhållanden på 1,5 – 2: 1 rekommenderas, med drop-förhållanden närmare 2: 1 typiskt stödja tillväxten av större 3-dimensionella kristaller. Slutligen är också avgörande mot kristalltillväxt användningen av lågprofil 24-brunnars plattor, förmodligen beroende på modifiering av hastigheten för ångdiffusion.
Ett alternativt tillvägagångssätt till SPA metoden har utvecklats för att skärmen för mutanter som stabiliserar råtta serotonintransportören i en kokain bunden konforma med hjälp av en filterbindningsanalys 5. Däremot SPA baSED analysen möjliggör sekventiella upphettningssteg följt av bestämning av den fraktion av Sert som är bundet till ligand. Således tillåter detta för snabb bestämning av smälttemperaturen från ett litet antal prover. SPA metod förlitar sig på tillgängligheten av en radiomärkt med hög affinitetsligand och om inga ligander är kända, vilka binder med submicromolar affinitet sedan ett alternativt tillvägagångssätt kommer att bli nödvändigt. Många andra metoder används allmänt för att mäta proteinstabilitet såsom bindning av fluorescerande färgämnen och kalorimetri 14 men är låg genomströmning och är antingen oförmögna att direkt mäta funktionen eller kräver stora mängder protein. Om SPA metoden inte kan användas, är ett alternativ med hög genomströmning tillvägagångssätt en FSEC-baserade Termostabilitet analys 15 (FSEC-TS), där provet värms följt av separation av den fraktion av resterande transportör. FSEC-TS är en användbar metod för att komma åt kromatografiska beteende och oligomera tillstånd och är apowerful kompletterande verktyg som kan användas tillsammans med SPA-metoden.
En jämförelse av olika gemensamma proteinexpressionssystem konstaterades också att främja användningen av däggdjursceller för SERT uttryck 16 och förvånande detta sannolikt är fallet för många proteiner av däggdjursursprung. De metoder som vi har använt för uttryck har skräddarsytts för SERT men sannolikt lätt anpassningsbar. Betingelser som gynnar höga nivåer av uttryck ska identifieras noggrant genom att variera tiden för uttryck, temperatur, viruskoncentration, och närvaron av histondeacetylas hämmare såsom natriumbutyrat.
Vi föredrar i allmänhet affinitetsrening i en mild lång kedja rengöringsmedel såsom C12M tillsammans med CHS före beredning för att behålla hög affinitet ligandbindning. Rekonstitution med användning av hydrofob absorption är en mild teknik som vi har funnit vara effektiva för flera andra transportörer och receptorer. Om det härär inte lyckas, avlägsnande av tvättmedel med hög kritisk micellkoncentration genom dialys, utspädning eller SEC kan användas 17 förutsatt att antigenet är tillräckligt stabil i sådana rengöringsmedel. I de fall där inga lämpliga antikroppar påträffas, vi nästan alltid hitta problemet beror på förlust av funktion eller denaturering av antigenet och i sådana fall vi framgångsrikt utfört nya vaccinationer med särskild uppmärksamhet på proteinbiokemi. Slutligen bör ligander och antikroppar som binder med hög affinitet ligger till grund för en rationellt planerad kristallisa experimentet och genom att dra fördel av ett termostabilt variant kan man screena ett bredare spektrum av betingelser genom att variera egenskaperna hos olika detergenter. Dessutom bör kristallisation i en lipidisk mesofas 18 eller med hjälp av bicelles 19 alltid betraktas som ett alternativ till kristallisation i miceller.
Dessa principer och metoder kan användas med viss modifikatjon för många andra transmembranproteiner, som är svåra att uttrycka och rena från andra expressionsvärdar, och kommer att vara speciellt användbara för strukturbestämning av måltavlor för hög affinitet droger.
The authors have nothing to disclose.
We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
IPTG | Anatrace | I1003 | |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
SF9 | ATCC | CRL-1711 | |
Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 0984018DJ | |
Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
Leupeptin | Sigma | L2884 | |
Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
Aprotinin | Sigma | A1153 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
Asolectin | Sigma | 11145 | |
Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
Lipid A | Sigma | L5399 | |
Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary for western blotting |
Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
Serotonin | Sigma | H9523 | |
pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
Imidazole | Sigma | 56749 | |
n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris used for preparation of crystallization reservoirs |
PEG 400 | Sigma | 91893 | |
6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
1 L filter system | Corning | 430517 | |
2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
Extruder | Northern Lipids | ||
Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
HPLC | Shimadzu | 51476 | |
Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
1 ml HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
Sertraline | Sigma | S6319 |