紫外可視およびラマン分光法イムノアッセイプラットフォームを製作
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
免疫アッセイは、関連する抗体の存在に基づいて、タンパク質を検出するために使用されます。そのため、研究と臨床現場での広範な使用の、免疫測定機器および材料の大規模なインフラを見つけることができます。例えば、96および384ウェルポリスチレンプレートは、市販されており、種々の製造業者からの紫外 – 可視（UV-Vis）で分光機を収容するために、標準的な設計を有します。また、このような酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）などのカスタマイズされた免疫アッセイの設計のための免疫グロブリン、検出タグ、およびブロッキング剤の多種多様なご利用いただけます。
既存のインフラストラクチャにもかかわらず、標準的なELISAキットは、高価で時間がかかる可能性が個別のイムノアッセイの開発を必要とする、すべての研究の必要性を満たしていません。彼らは通常、蛍光またはCOLに依存するように例えば、ELISAキットは、低多重化（一度に複数の分析物の検出）機能を持っています検出のためのorimetric方法。比色や蛍光ベースの分析は、広いスペクトルのピークに起因する多重化機能が制限されています。対照的に、ラマン分光法に基づく方法は、狭い放射ピークのために多重化するためのはるかに高い能力を有します。ラマン分光法の別の利点は、ラマンレポーターは、蛍光タグ1よりも大幅に少ない光退色が発生することです。ラマンレポーターは、蛍光比色タグの上に持っていることを利点にもかかわらず、ラマンベースのイムノアッセイを製造するためのプロトコルは限られています。この論文の目的は、UV-Visの分析及びラマン分光法による分析物の直接検出のためのポリスチレンプレートと組み合わせて使用するために官能化プローブを調製するためのプロトコルを提供することです。このプロトコルは、事前に確立されたインフラストラクチャを活用しながら、研究者は、将来の多検体の検出のための日曜大工のアプローチを取ることができます。
Introduction
典型的なサンドイッチイムノアッセイは、間接的に二つの抗体を用いて抗原の存在を検出します。捕捉抗体は、固体表面に結合したときに適切な抗原に近接して抗体 – 抗原複合体を形成します。検出抗体は、次いで、導入された抗原に結合します。洗浄後、抗体/抗原/抗体複合体が残存し、 図1Aに示されたように標識した検出抗体によって検出されます。典型的な検出は、広いスペクトルのピーク2,3に起因する10の検体に多重化を制限し、蛍光または比色検出器によって行われます。これとは対照的に、ラマンベースのシステムには、最大100の検体2,3の同時検出を主張ソースで強化された多重化機能が得られはるかに狭い発光ピークを持っています。
このようなステップ・バイ・ステップとして6 –多くの文献情報源は、イムノアッセイ4に関連する重要な側面をカバーしているご利用いただけます詳細は、パーソナライズされたELISAキットを作成します。残念ながら、これらのプロトコルは、カスタマイズされた免疫アッセイの多重化能力を制限し、蛍光または比色検出のためのものです。この必要性に対処するために、我々は、 図1Bに示すように、直接イムノアッセイについて以前に公開され7 UV-可視/ラマンイムノアッセイを作製する詳細な手順を提示します。
このプロトコルは、図2に示した官能基化金ナノ粒子ベースのプローブの製造を含んでいる。ラマン/ UV-Visのプローブを作成する手順は、金ナノ粒子（AuNPs）の表面にラマンレポーターを結合することによって開始します。 AuNPsは、その後、ポリエチレングリコール（PEG）と関連している抗体を用いて官能化されます。 AuNPsの残りの結合部位は、分析の間の結合、その後の非特異を防止するAuNPsにメトキシポリエチレングリコールチオール（MPEG-SH）を結合することによってブロックされます。準備AuNPプローブは、抗原に結合することによってテストされます図1Bに示すように、ポリスチレンプレートのウェルに固定されています。関連ラマンレポーターは、ラマン分光法を用いて検出している間にプレートを洗浄すると、AuNPプローブは、紫外可視分光法を用いて検出されます。 UV-Visのラマンスペクトルデータを組み合わせることにより、この免疫アッセイの能力を強化、分析の2つのメソッドを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
詳細なプロトコルでは、対処するためのいくつかの重要なポイントがあります。 1つの問題は、ラマンレポーターと金ナノ粒子の選択です。プロトコルは、個々の使用に適合するように書かれたが、ラマンレポーターDTTCを例として使用しました。 DTTCは、正に帯電したレポーターであり、負のクエン酸キャップ化AuNPsなどの表面に帯電するために特異的に結合します。このプロトコルは、正の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
