longitudinal<em> I Vivo</em> Imaging av Cerebrovasculature: Relevans til CNS sykdommer
Summary
Dette manuskriptet beskriver en prosedyre for å spore ombygging av cerebrovasculature under amyloid plakk opphopning in vivo ved hjelp av langsgående to-foton mikroskopi. En tynnet-skalle preparat muliggjør visualisering av fluorescerende fargestoffer for å vurdere utviklingen av cerebrovaskulær skade i en musemodell av Alzheimers sykdom.
Abstract
Ombygging av hjernen blodkar er et felles trekk av hjernesykdommer. In vivo imaging teknikker er grunnleggende for å oppdage cerebrovaskulær plastisitet eller skade som oppstår overtid og i forhold til neuronal aktivitet eller blodstrøm. In vivo to-foton mikroskopi tillater studiet av det strukturelle og funksjonelle plastisitet av store cellulære enheter i levende hjerne. Spesielt lar tynnet-skalle vindu forberedelse visualisering av kortikale områder av interesse (ROI) uten å indusere betydelig hjernebetennelse. Gjentatte bildebehandling økter av kortikale ROI er gjennomførbart, og gir karakterisering av sykdoms kjennetegnene over tid under utviklingen av en rekke CNS-sykdommer. Denne teknikken å få tilgang til pial strukturer innenfor 250 pm av hjernen er avhengig av deteksjon av fluorescerende prober som kodes for av genetiske cellulære markører og / eller vitale fargestoffer. Sistnevnte (f.eks fluorescerende dekstraner) brukes til å kartlegge Luminal rommet for cerebrovaskulære strukturer. Viktig til protokollen som er beskrevet her, er bruken av en in vivo markør av amyloidavsetninger, metoksy-O4, for å vurdere Alzheimers sykdom (AD) progresjon. Vi beskriver også etter oppkjøpet bildebehandling brukes til å spore vaskulære endringer og amyloid avleiringer. Mens fokus i dag på en modell av AD, er den beskrevne protokollen relevant for andre forstyrrelser i sentralnervesystemet hvor patologiske cerebrovaskulære endringer oppstår.
Introduction
Hjernen blodkar er en multi-cellulær struktur, som er anatomisk og funksjonelt koblet til neuroner. En dynamisk remodellering av fartøyer skjer gjennom utvikling av hjernen og under progresjon av sykdomstilstander i sentralnervesystemet (CNS) 1,2. Det er allment akseptert at cerebrovaskulær skade er et kjennetegn på flere CNS sykdommer, inkludert epilepsi, Alzheimers sykdom (AD), traumatisk hjerneskade og encefalitt 3,4. Derfor sporing cerebrovaskulære endringer in vivo blir betydelig når modellering CNS sykdommer, fra starten og til kroniske faser. Som cerebrovaskulære modifikasjoner forekommer ofte samtidig med nerveskader eller plastisitet, avbildning av neuro-blodkar representerer en viktig inngangspunkt å dechiffrere CNS sykdom patofysiologi.
Denne protokollen beskriver en langsgående to-foton basert fremgangsmåte for å spore ombygging av cerebrovasculature i en musemodell avAD, en progressiv patologi preget av cerebrovaskulære feil på store og små kaliber fartøy på grunn amyloidogene avleiring 5-7. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for visualisering av amyloide avleiringer og for sporing av deres posisjon og vekst i forhold til neurovaskulær remodellering gjennom hele sykdomsforløpet. Vital fluorescerende fargestoffer injiseres før hver avbildning sesjon for visualisering av cerebrovasculature og amyloid plakk i transgene AD mus 8. Gjentatte bildebehandling økter med en avkastning gjennom en tynnet skallen transkranial vindu er ikke-invasiv og metoden for valg for å vurdere neurovascular ombygging i levende mus hjernen 2,5,9,10.
Prosedyren nedenfor beskriver den kirurgiske protokollen, image oppkjøpet og behandling. Den tidlige utviklingen av cerebral amyloid angiopati (CAA) for det meste på frifot leptomeningeal og gjennomtrengende arterioler er preget.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den åpne skallen teknikk for in vivo to-foton mikroskopi har fordelen av ubegrenset bilde økter med store bildefelt 13,14. Men denne teknikken gir også betennelse i regionen av interesse 14, ofte inkompatible eller påvirke nevro-vaskulære lese-outs 15. Tvert imot, blir det fortynnede skallen brukes trans teknikk ikke resultere i neuro-inflammasjon, slik at pålitelig avbildning av strukturene og cerebrovaskulære plakk akkumulering 10,14. En annen fordel presente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Ligue Francaise contre l'épilepsie (til MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE Grant AVENIR R12087FS (til FJ), gi fra universitetet i Montpellier (til FJ) og stipend fra Federation pour la Recherche sur le Cerveau (til NM). Vi erkjenner teknisk assistanse av Chrystel Lafont på IPAM in vivo avbildning kjerne plattform innretningen av Montpellier. Vi takker også Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/Kg |
| FITC-Dextran 70Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/Kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
- Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).
- Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period. Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).
- Masamoto, K., et al. Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).
- Marchi, N., Lerner-Natoli, M. Cerebrovascular remodeling and epilepsy. Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).
- Giannoni, P., et al. Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer’s disease. Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).
- Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer’s disease. Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).
- Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Liston, C., et al. Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance. Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Klunk, W. E., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. J Vis Exp. (71), (2013).
- Holtmaat, A., et al. Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Joseph-Mathurin, N., et al. Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds. Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).
- Sadowski, M., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
