longitudinell<em> In Vivo</em> Avbildning av Cerebrovasculature Relevans till CNS-sjukdomar
Summary
Detta manuskript beskriver ett förfarande för att spåra ombyggnad av cerebrovasculature under amyloida plack ackumulering in vivo med hjälp av längd två-foton mikroskopi. En förtunnas-skalle beredningen möjliggör visualisering av fluorescerande färgämnen för att bedöma progressionen av cerebrovaskulär skada i en musmodell av Alzheimers sjukdom.
Abstract
Remodellering av hjärnan kärlsystemet är ett gemensamt drag av hjärn patologier. In vivo avbildningstekniker är grundläggande för att upptäcka cerebrovaskulär plasticitet eller skador uppkommer övertid och i förhållande till nervaktivitet eller blodflöde. In vivo två-foton mikroskopi tillåter studiet av strukturella och funktionella plasticitet stora cellulära enheter i vardags hjärnan. I synnerhet tillåter tunnas-skalle fönster förberedelse visualisering av kortikala regioner av intresse (ROI) utan att framkalla betydande hjärninflammation. Repetitiva avbildning sessioner av kortikal ROI är möjliga, vilket ger karakterisering av sjukdoms kännetecken över tiden under utvecklingen av ett stort antal CNS-sjukdomar. Denna teknik att komma åt de pial strukturer inom 250 | im av hjärnan är beroende av detekteringen av fluorescerande prober som kodas av genetiska cellulära markörer och / eller vitala färgämnen. De senare (t.ex. fluorescerande dextraner) används för att kartlägga den luminal utrymmet i cerebrovaskulära strukturer. Relevant för det protokoll som beskrivs häri är användning av en in vivo-markör av amyloidavsättningar, metoxi-O4, för att bedöma Alzheimers sjukdom (AD) progression. Vi beskriver även efter förvärvet bildbehandling används för att spåra kärlförändringar och amyloidavsättningar. Även för närvarande fokuserar på en modell av AD, är den beskrivna protokollet är relevant för andra CNS-sjukdomar där patologiska cerebrovaskulära förändringar inträffar.
Introduction
Hjärnan vaskulaturen är en multi-cellulär struktur, som anatomiskt och funktionellt är kopplad till neuroner. En dynamisk remodellering av kärl förekommer i hela hjärnans utveckling och under framskridandet av patologier i det centrala nervsystemet (CNS) 1,2. Det är allmänt accepterat att cerebrovaskulär skada är ett kännetecken för flera CNS-sjukdomar, inklusive epilepsi, Alzheimers sjukdom (AD), traumatisk hjärnskada och hjärninflammation 3,4. Därför, spårning cerebrovaskulära förändringar in vivo blir betydande när modellering CNS-sjukdomar, från början och till kroniska faser. Som cerebrovaskulära ändringar förekommer ofta tillsammans med nervskada eller plasticitet, avbildning av neurokärl utgör en viktig inkörsport för att dechiffrera CNS-sjukdom patofysiologi.
Detta protokoll beskriver en längsgående två-foton-baserat förfarande för att spåra ombyggnaden av cerebrovasculature i en musmodell avAD, en progressiv patologi kännetecknas av cerebrovaskulära defekter på stora och små kaliber fartyg på grund av amyloidogena plack nedfall 5-7. Detta förfarande gör det möjligt för visualisering av amyloidavsättningar och spårning av deras position och tillväxt med avseende på neurovaskulära ombyggnad hela sjukdomsförloppet. Vitala fluorescerande färgämnen injiceras före varje bildsession för visualisering av de cerebrovasculature och amyloida plack i transgena AD möss 8. Upprepade avbildning sessioner av en ROI genom en förtunnad skallen transkraniell fönster är icke-invasiv och metoden för valet att bedöma neurovaskulära ombyggnad i vardags mushjärna 2,5,9,10.
Proceduren nedan visar den kirurgiska protokollet, bildtagning och behandling. Den tidiga utvecklingen av cerebral amyloid angiopati (CAA) mestadels i stort leptomeningeal och penetrerande arterioler karaktäriseras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den öppna skallen teknik för in vivo två-foton mikroskopi erbjuder fördelen av obegränsad avbildning sessioner stora avbildningsfält 13,14. Emellertid denna teknik producerar också inflammation i regionen av intresse 14, ofta inkompatibla eller impac neuro-vaskulära read-outs 15. Tvärtom gör den uttunnade skallen transkraniell teknik som inte resulterar i neuro-inflammation, vilket möjliggör tillförlitlig avbildning av de cerebrovaskulära strukturer och plackansaml…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Ligue Francaise contre l'épilepsie (MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Grant AVENIR R12087FS (till FJ), bevilja från universitetet i Montpellier (till FJ) och bidrag från Federation pour la Recherche sur le Cerveau (till NM). Vi erkänner tekniskt stöd från Chrystel Lafont på IPAM in vivo imaging kärnplattform anläggningen i Montpellier. Vi tackar också Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) för korrekturläsning manuskriptet.
Materials
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/Kg |
| FITC-Dextran 70Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/Kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
- Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).
- Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period. Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).
- Masamoto, K., et al. Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).
- Marchi, N., Lerner-Natoli, M. Cerebrovascular remodeling and epilepsy. Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).
- Giannoni, P., et al. Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer’s disease. Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).
- Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer’s disease. Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).
- Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Liston, C., et al. Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance. Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Klunk, W. E., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. J Vis Exp. (71), (2013).
- Holtmaat, A., et al. Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Joseph-Mathurin, N., et al. Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds. Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).
- Sadowski, M., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
