Получение первичных смешанных глиальных культур от взрослых спинного мозга мыши ткани

Summary

Развитие невропатической боли включает в себя патологические изменения спинного мозга глиальных клеток. Надежная система глиальных культуры происходит от взрослой ткани спинного мозга и предназначен для изучения этих клеток в пробирке отсутствует. Таким образом, мы покажем здесь, как установить первичные смешанные глиальные культуры от взрослых мышей ткани спинного мозга.

Abstract

Он общепризнан, что спинного мозга глиальные ответы вносят значительный вклад в развитие нейропатической боли. Потрясающая информация о глиальных деятельности на клеточном и молекулярном уровнях было получено с помощью лабораторных систем культивирования клеток в. Системы ин витро , используемые, в основном , включают в себя первичный глии , полученный из головного мозга новорожденных кортикальной ткани и линии иммортализованных клеток. Однако эти системы не могут отражать характеристики спинного мозга глиальных клеток в естественных условиях. Для дальнейшего изучения роли спинного мозга глиальных клеток в развитии периферических нервов травмы , вызванной невропатической боли с использованием системы культуры , которая лучше отражает состояние в естественных условиях, наша лаборатория разработала метод для установления первичного спинного мозга смешанных глиальных культур от взрослых мышей. Вкратце, спинной мозг собраны от взрослых мышей и обрабатываются через папаином с последующим удалением миелина с притонов черезность-градиентной среды. Одноклеточных суспензий культивируют в модифицированной Eagle средах полном Дульбекко (cDMEM) с добавлением 2-меркаптоэтанол (2-ME) при 35,9 ^о С. Эти условия культивирования были оптимизированы специально для роста смешанных глиальных клеток. В этих условиях, клетки готовы к использованию для проведения экспериментов между 12 – 14 г (клетки, как правило, находятся в лог-фазе в течение этого времени) после установления культуры (D 0) и может быть сохранена в условиях культивирования до D 21. Эта система культуры можно использовать для исследования реакции спинного мозга глиальных клеток при стимуляции различными веществами и агентами. К тому же невропатической боли, эта система может быть использована для изучения ответов глиальные при других заболеваниях, которые включают патологические изменения спинного мозга глиальных клеток.

Introduction

Хроническая боль является серьезной проблемой здравоохранения , которая затрагивает около 100 миллионов взрослых в Соединенных Штатах, с предполагаемой годовой стоимостью до $ 635 миллиардов ^1. Монтажные доказательства показали значительный вклад спинного мозга глиальных клеток в развитии нейропатической боли, одной из самых разрушительных видов хронической боли ^2. Надлежащая в пробирке системы культуры значительно помочь в дальнейшем исследовании роли глиальных клеток на клеточном и молекулярном уровнях.

В настоящее время экстракорпорального системы культуры глиальные в используемых исследователями в основном включают глиальные клетки , полученные из тканей коры головного мозга у новорожденных мыши или крысы мозга и увековечил глиальные клеточные линии , полученные из неонатальной мыши или крысы первичных клеток глии. Неонатальные клетки содержат значительное количество недифференцированных клеток, которые могут быть дополнительно дифференцировались в глиальные клетки (преимущественно астроциты и микроглии), обеспечивая тем самымbundant клетки для экспериментального использования ^3. Тем не менее, наше предыдущее исследование показало, что неонатального мозга глиальные клетки отреагировали значительно отличается от взрослого спинного мозга глиальных клеток при липополисахарида (LPS) стимуляции. Например, интерлейкин (IL) -4 отображается усиление ингибирующего эффекта на ЛПС-индуцированную оксида азота (NO) , производство в взрослых крыс спинного мозга нейроглии по сравнению с неонатальной глии мозга ^4. Кроме того, профили производства хемокинов при стимуляции нейропептида, кальцитонин ген-родственный пептид (CGRP), являются неоспоримо отличаются между неонатальной мыши глии мозга (методами , описанными в работе. 5) , а также для взрослых спинного мозга мыши глии (Рисунок 1). Признанные клеточные линии просты в использовании и обслуживании, и может обеспечить большое количество клеток в течение короткого периода времени. В общем, иммортализованные клеточные линии генерируются либо с помощью вирусов-опосредованной системы иммортализации (например, широко используемой линии клеток микроглии BV2) ^{6, 7} или после гое определение спонтанной трансформации (например, астроциты клеточной линии C8-D1A и микроглии клетки линии C8-B4) ^{8, 9} Клеточные линии превосходны в изучении молекулярных характеристик астроцитов и микроглии в отдельности.; Тем не менее, результаты , полученные из клеточных линий всегда требует дальнейшей проверки в первичных клетках или в условиях in vivo на . Следует также отметить, что не было отчета о глиальной клеточной линии, который является производным от грызуна спинного мозга глии.

Чтобы помочь исследовать роль спинного мозга глиальных клеток в развитии нейропатической боли, системы культуры , который является производным от взрослого спинного мозга мыши была разработана путем адаптации ранее сообщенному метод , используемый для генерации взрослых крыс смешанных глиальных культур ^{4, 5} . мышь спинного мозга глиальные культуры дополнительно рафинированные в последнее время ¹⁰ и описан более подробно в этой статье. Взрослые спинного мозга смешивают глиальные культуры сбыть установлена ​​с помощью мыши из отобранных штаммов, которые соответствуют потребностям конкретного исследования, и клетки могут поддерживаться в культуре до 21 d размещать начало культуры. Этот метод может быть использован при невропатической боли исследований, а также при исследовании различных неврологических заболеваний, которые вовлекают патологические изменения в спинном мозге, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) -associated сенсорной невропатии, а также несколько склероз (РС).

Protocol

Следующий протокол был одобрен животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) в Университете Новой Англии. Следующий протокол для подготовки глиальных культур от 4 взрослых мышей спинного мозга. 1. Приготовление растворов в культуре Гуда в асептических условиях …

Representative Results

Этот метод может быть использован для получения смешанных глиальные клетки от мышей и крыс. Среднее общее количество клеток на лунку в 12-луночный планшет на D 12 после начала культивирования должна быть относительно стабильной, причем около 100000 клеток на лунку, когда к?…

Discussion

Крайне важно, чтобы выполнить все шаги, в том числе в средствах массовой информации меняющейся график-последовательным образом для того, чтобы получить воспроизводимые результаты между экспериментами. Следующие шаги особенно важны в получении отличного качества для взрослых смешанн…

Materials

Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose	Lonza	12-709F	The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x)	Lonza	17-605E	The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.
2-mercaptoethanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Individual components of this kit can be purchased separately.
Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595	Sigma-Aldrich	L-9764	Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY406	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA	R&D Systems	DY410	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA	R&D Systems	DY466	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set	BD Biosciences	555260	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex	Quansys Biosciences	120251MS	This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)	eBioscience	17-0451	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)	eBioscience	11-0112	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences	BD Accuri C6	Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software	Tree Star, Inc.	FlowJo7.6.5	Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.