Een methode voor het extraheren Pigmenten van Squid<em> Doryteuthis pealeii</em
Summary
Een protocol voor de extractie van de pigmenten uit de nanostructuur korrels in squid Doryteuthis pealeii chromatoforen wordt gepresenteerd.
Abstract
Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.
Introduction
Koppotigen zoals inktvis, inktvis en octopus hebben de mogelijkheid om hun uiterlijk te camoufleren en signalering dynamisch veranderen. 1-6 Deze mogelijkheid wordt mede ondersteund door de selectieve areal uitbreiding van gepigmenteerde organen bekend als chromatoforen. 4,7-9 chromatoforen zijn zachte actuatoren die een netwerk van nanogestructureerde pigmentkorrels voordoen binnen cytoelastic sacculus radiaal is verankerd door spiervezels bevatten. 1,3 Daar ze bediend, chromatoforen breiden met 500% in gepresenteerd oppervlak verspreiden van de granules gedurende het orgel. 3,7 , 10,11 Wanneer deze actie onderling over een aantal chromatoforen de totale kleur van het dier wordt gewijzigd. Hoewel bekend is dat de pigmentkorrels bijdragen kleurverandering, de samenstelling is onbekend. We beschrijven een werkwijze voor het isoleren en zuiveren chromatophore pigmenten die kunnen worden aangepast voor toekomstig compositiestudies.
<p class = "jove_content"> De isolatie van pigmentkorrels gaat om een meerdere stappen extractie, homogenisering, en zuivering procedure. 3,12 Chromat die weefsel wordt geoogst door zorgvuldige uitroeiing van de inktvis. Een digestie en homogeniseren wordt vervolgens gebruikt om het omringende weefsel dissociëren en scheiden de chromatophore cellen. De nanostructuur korrels zijn vervolgens geïsoleerd en gezuiverd uit de resterende chromatoforen met behulp van herhaalde sonicatie en centrifugeren. Na zuivering, worden pigmenten gewonnen uit de korrels in een proces dat geschikt is bij de winning van zichtbare kleur van vlindervleugels middels zure methanoloplossingen. 13 Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en spectrofotometrie worden gebruikt om te bevestigen dat de chromatophore pigmenten met succes worden geëxtraheerd door gebruik dit proces.Deze werkwijze beschrijft de isolatie van chromatophore granules die wordt gebruikt om de moleculaire bijdragen c staandoloration in koppotigen. 12 kleine molecule extracties van gehele dieren kan vaak een lang en moeizaam proces zijn. Het doel is om toekomstige onderzoekers van een effectieve en gemakkelijke protocol te informeren voor de verwerving van pigmenten uit de nanostructuur korrels in koppotigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een methode om pigmenten pijlinktvis chromatophore granules extract aangetoond. Door specifiek te richten op de korrels, ons doel is om hun rol in het bemiddelen van adaptieve kleur te bepalen. Deze methode verschilt van eerdere rapporten ontworpen om cephalopod pigmenten te karakteriseren met behulp van bulk weefselmonsters 14 of gevriesdroogd huid 15.
Hoewel dit protocol is effectief bij het extraheren chromatophore pigmenten wordt beperkt tot kleine reactie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the use of facilities at the University of New Hampshire including the University Instrumentation Center. This work was supported by the University of New Hampshire, Department of Chemistry.
Materials
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118, (2016).
