Метод извлечения Пигменты из кальмаров<em> Doryteuthis pealeii</em
Summary
Протокол для извлечения пигментов из наноструктурированных гранул в кальмара Doryteuthis pealeii хроматофоров представлена.
Abstract
Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.
Introduction
Головоногие , такие как кальмары, каракатицы и осьминоги имеют возможность динамически изменять их внешний вид для маскировке и сигнализации. 1-6 Эта возможность поддерживается частично за счет селективного расширения ареала пигментных органов , известных как хроматофоров. 4,7-9 Хроматофоры являются мягкие приводы , которые содержат сеть наноструктурированных гранул пигмента заключены внутри cytoelastic саккулюса, которая закрепляется в радиальном направлении от мышечных волокон. 1,3 Как они приводятся в действие, хроматофоры расширить на 500% площади поверхности , представленной распределяя гранулы по всему органу. 3,7 , 10,11 Когда это действие согласованные в течение ряда хроматофорами, общая окраска животного изменяется. Хотя известно, что гранулы пигмента способствуют этому изменению цвета, их состав остается неизвестным. Опишем процедуру для выделения и очистки хроматофора пигменты, которые могут быть адаптированы для будущих композиционными исследований.
<p claсс = "jove_content"> Выделение гранул пигмента включает многоступенчатую экстракцию, гомогенизацию и процедуру очищения. 3,12 хроматофора содержащий ткани собирают путем тщательного экстирпации из головоногих. Процесс переваривания и гомогенизация затем используется для диссоциировать окружающие ткани и отделяют хроматофора клетки. Наноструктурные гранулы затем выделяют и очищают из оставшихся хроматофорами повторными ультразвуковую обработку и центрифугирование. После очистки, пигменты извлекаются из гранул в процессе , который приспособлен от добычи видимого цвета с крыльями бабочки с использованием кислых растворов метанола. 13 с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) и спектрофотометрии используются для подтверждения того, что хроматофора пигменты успешно извлечены с помощью этот процесс.Этот метод описывает выделение хроматофора гранул, который используется для изучения молекулярных вклад в Coloration в головоногих. 12 Небольшие молекулы Выписки из всех животных часто может быть долгим и трудоемким процессом. Целью здесь является информирование будущих исследователей эффективного и легкому протокола для приобретения пигментов из наноструктурированных гранул в головоногих.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы продемонстрировали метод извлечения пигментов из кальмаров хроматофора гранул. Конкретное ориентации гранул, наша цель состоит в том, чтобы определить их роль в опосредовании адаптивную окраску. Этот метод отличается от предыдущих отчетов , предназначенных для характеристики гол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the use of facilities at the University of New Hampshire including the University Instrumentation Center. This work was supported by the University of New Hampshire, Department of Chemistry.
Materials
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
- Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
- Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
- Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
- Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
- Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
- Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
- Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
- Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
- Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
- Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
- Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
- Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
- Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
- Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118, (2016).
