초파리 널리 신경 퇴행을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용된다. 이 프로토콜은, 뇌의 공포 형성에 의해 결정된 바와 같이, 정량 할 수있는 변성하는 방법을 설명한다. 또한 인해 하나의 샘플로 처리 및 절편 제어 및 실험 파리에 의해 실험 절차에 효과를 최소화 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
알츠하이머 병 (AD) 또는 파킨슨 병 (PD)와 같은 진보적 인 신경 퇴행성 질환은 전 세계적으로 사람의 건강에 위협이 증가한다. 포유 동물 모델은 병원성의 기전에 중요한 통찰력을 제공하고 있지만, 함께 높은 비용 포유류 시스템의 복잡성은 자신의 사용을 제한하고 있습니다. 따라서, 간단하지만 잘 확립 된 초파리 모델 시스템은 이러한 질병에 영향을 분자 경로를 조사하기위한 대안을 제공합니다. 행동 적자 외에도, 신경 퇴행성 질환 등 신경 죽음과 axonopathy 등의 조직 학적 표현형을 특징으로한다. 신경 세포의 변성을 정량화하고는 유전 적, 환경 적 요인에 의해 영향을받는 방법을 결정하기 위해, 우리는 성인 플라이 뇌에서 공포 측정을 기반으로하는 조직 학적 접근 방법을 사용합니다. 계통 오차의 영향을 최소화하기 위해 직접적으로 제어 및 경험치의 섹션을 비교하나 준비 erimental 파리, 우리는 파라핀 섹션의 '칼라'방법을 사용합니다. 신경 퇴행은 플라이 뇌 개발 액포의 크기 및 / 또는 개수를 측정하여 평가한다. 이것은 하나의 관심의 특정 영역에 집중하거나 완전한 헤드 걸쳐 직렬 부분을 취득하여 전체 뇌를 분석함으로써 수행 될 수있다. 정상적인 노화 중에 발생 따라서,이 방법은, 하나는 심한 변성뿐만 아니라 몇 부분 만 감지 상대적으로 약한 표현형뿐만 아니라 측정 할 수 있습니다.
서론
기대 수명의 증가와 함께, 알츠하이머 나 파킨슨 병 같은 신경 퇴행성 질환은 일반 인구 증가 건강에 위협이되고있다. 국립 보건원에 따르면 115 만명 전세계 기본 상당한 진전이 많은 분야에서 이들 질환의 적어도 일부에 관여하는 유전자와 위험 요인을 식별 하였지만 2050 치매에 의해 영향을받을 것으로 예상되는 분자 메커니즘은 여전히 알 수없는 여부를 잘 이해한다.
예쁜 꼬마 선충과 초파리 melanogaster의 같은 간단한 무척추 동물 모델 생물은 짧은 라이프 사이클, 자손의 많은 수의, 잘 설립 때로는 독특한 유전 및 분자 방법 1의 가용성을 포함한 신경 퇴행성 질환의 메커니즘을 연구하는 실험 다양한 장점을 제공합니다 -12. 또한, 이러한 유기체는 편견 의무가 있습니다신경 퇴행성 표현형에 자신의 악화 또는 의한 개선 효과에 의해 이러한 질병에 기여하는 요인을 식별 할 수있는 상호 작용 화면.
이러한 유전자의 상호 작용을 분석하고 노화 효과를 평가하는 신경 퇴행을 검출하고 그 심각도를 측정하는 정량적 프로토콜을 필요로한다. 숫자 성능 값 13-21을 제공하는 등 후각 학습, 부정적인 geot....
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프로토콜
1. 칼라의 머리를 고정하고 파라핀에 임베드
주 : 정착 프로세스의 모든 단계는 흄 후드에서 수행되어야한다. 건강 위험 포즈를하지 않으면 서 메틸 벤조 에이트는, 흄 후드에서 처리되지 않는 경우에 압도 될 수있는 매우 독특한 냄새를 가지고있다.
- 파리를 마취 전에 클로로포름 15 ㎖의 99 % 에탄올 30 ㎖에 빙초산을 5 ㎖ (클로로포름 및 아세트산을 혼합하지 않음)에 추가하여 Carnoy 용액 50 ㎖를 구성한다. 칼라 평면 놓을 수 완전히 솔루션이 적용되는 것을 보장하기 위해, 이러한 crystalizing 접시 같은 평평한 바닥과 유리 용기에 붓는다.
- CO 2 또는 에테르와 함께 파리를 마취.
- 집게를 사용하여 칼라로 목에 의한 스레드 파리 (최대 대부분의 칼라와 20). 그림 1A에서와 같이, 같은 방향으로 머리를 모두 맞춘 손상 머리 나 눈에 발생하지 않도록 부드럽게해야합니다.
- 파리의 순서가 쉽게 부분에서 식별 될 수 있도록 임의의 위치에서 사인 oculis 파리 (화살표,도 1a)를 포함한다. 실험 파리는 빛 또는 흰색 눈 색깔이있는 경우 또한, 같은 야생형 같은 일부 빨간색 파리, 스레드 그들 사이....
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결과
전체 플라이 헤드를 포함 눈 안료 (33)에 의해 스테인드 시리얼 섹션에 설명 된 방법의 결과를 사용. 이것의 일부는 각각의 헤드의 부분이 위로부터 아래로 도시되어도 1b에 도시된다. 다른 파리에서 섹션이 예에서 왼쪽에서 오른쪽으로 볼 수 있습니다. 방향과 파리의 식별을 용이하게하기 위해, 눈이없는 비행 (사인 oculis)의 위치 3 (화살표, 그림 1B)에서 마커로 삽입됩니다.
신경 퇴행을 정량화하기 위해,이 부분에서 검출 할 수 액포의 형성을 측정한다. 액포가 라운드로 정의된다, 녹색 형광 neuropil 내에서 (그림 2의 화살촉 3) 또는 피질과 어두운 반점은 즉시 뇌의 이상이 연속 섹션에서 볼 .......
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토론
설명 된 방법은 초파리의 뇌 퇴행을 정량하는 방법을 제공한다. 특정 세포 유형을 계산하는 등의 다른 방법이, 신경 퇴행을 식별하는 데 사용될 수 있지만,이 방법의 장점은,보다 일반적으로 적용 할 수 있다는 것이다. 세포를 계수하는 것은 이들 세포를 확실하게 특정 항체 또는 항상 가능하지 않은 세포 특이 마커의 발현을 사용하여 식별 될 수있는 것을 요구한다. 또한,이 극적으로 다른 결과 아마도 의한 라벨링 및 검출에 사용되는 조건을, 그 방법 (24)을 얻을 수있다 나타났다. 퇴화 세포를 검출하는 또 다른 방법은 그러나 반대로 활성 카스파 제 3과 같이, 이것은 적극적 세포 사멸을 겪는 세포를 식별하지 않고 세포가 사망하면 더 이상 검출하고, 세포 죽음 마커의 사용이다. 여기에서 제안 된 방법의 다른 장점은 오염 인해 autoflu에 필요하지 않다는 것이다시간을 절약하고 오염 조건의 변화에 의한 아티팩트를 최소화 눈 안료 의한 orescence. 또한이 방법을 사용하는 경우, 파리의 눈 슬.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 연구는 오레곤 의학 연구 재단(Medical Research Foundation of Oregon)과 NIH/NINDS(NS047663)의 보조금으로 지원되었습니다. E.S.는 NIH(T32AG023477)의 교육 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약/장비 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 칼라 | Genesee Scientific | TS 48-100 | 우리는 Genesee의 것과 같은 레이어 대신 한 조각의 금속으로 만든 맞춤형 칼라를 사용하고 있습니다. 목걸이를 만드는 방법에 대한 설명은 http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 에서 찾을 수 있습니다. |
| 가정용 상점 | 임베딩용 고무 아이스 큐브 트레이 | 크기는 추가 벽에 접착제로 붙여서 맞춤 제작할 수 있습니다 | |
| 결정화 접시 | 피셔 사이언티픽 컴퍼 | 08-762-3 | |
| 에테르 | 피셔 사이언티픽 컴퍼니 | E138-1 | |
| 에탄올 | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| 빙하 아세트산 | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| 메틸 벤조 에이 | 트 Fisher Scientific Company | M205-500 | 뚜렷한 냄새 - 흄 후드에 사용! |
| 낮은 융점 파라핀 왁스 | Fisher Scientific Company | T565 | 65°C에서 추가로 녹은 상태로 유지하십시오. C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 자동 절단 | |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| 현미경 커버 유리 | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | 세척을 위한 세 가지 다른 용기 |
| 수직 염색 항아리 표지 | : Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| 폴리-L-라이신 솔루션(PLL) | 시그마 생명 과학 | P8290-500 |
참고문헌
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279(2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using....
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재인쇄 및 허가
