उच्च throughput रोबोट-समर्थित में तापमान के प्रति संवेदनशील घातक म्यूटेंट के अलगाव<em> Chlamydomonas reinhardtii</em

Summary

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Abstract

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii¹. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

Introduction

मॉडल जीवों के व्यवस्थित उत्परिवर्ती संग्रह की प्ररूपी लक्षण वर्णन सेलुलर जटिलता विदारक के लिए एक सिद्ध दृष्टिकोण है। अगुणित कोशिकीय हरी शैवाल Chlamydomonas reinhardtii एक संयंत्र की तरह जीन सेट है, लेकिन यह भूमि संयंत्र ² वंश में कई जीनोम दोहराव से पहले भूमि पौधों से अलग हुए। सिद्धांत रूप में, जीन दोहराव और एक मुख्य रूप से अगुणित जीवन चक्र की कमी बहुत हानि के समारोह आनुवंशिक दृष्टिकोण की सुविधा। हालांकि, ब्याज की जीन की लक्षित व्यवधान कुशल मुताबिक़ जीनोमिक एकीकरण की कमी के कारण लगभग असंभव है। एक यादृच्छिक इन्सर्शनल व्यवधान पुस्तकालय का निर्माण किया जा रहा है, बाधित साइट की पहचान के साथ संयुक्त, अब तक 1935 मैप किया 1,562 जीन ³ का प्रतिनिधित्व करने वाले अवरोधों का एक arrayed सेट उपज। हालांकि, इस दृष्टिकोण (सामान्य में उम्मीद अशक्त म्यूटेशन का उत्पादन करने के लिए) आवश्यक जीनों के लिए लागू नहीं है। तापमान के प्रति संवेदनशील (टीएस) म्यूटेशन recovere जा सकती हैआवश्यक जीन में डी, और हाल के तरीकों उत्परिवर्तित जीन और प्रेरणा का घाव के कुशल पहचान देते हैं। उच्च तापमान पर प्ररूपी विश्लेषण तो उत्परिवर्तित जीन के समारोह के बारे में तत्काल जानकारी प्रदान करता है। हम अलगाव और ~ 70 Chlamydomonas में आवश्यक जीन में म्यूटेशन टीएस घातक के लक्षण वर्णन पर सूचना दी, कोशिका चक्र प्रगति में शामिल जीनों पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित है और ^1,4 नियंत्रित करते हैं।

टीएस घातक स्क्रीन दशकों ^5,6 के लिए सूक्ष्मजीवों में आनुवांशिक विश्लेषण का एक मुख्य आधार किया गया है। सिद्धांत रूप में, एक वांछनीय विशेषता "संतृप्ति," जिसका अर्थ है कि सभी मारक टीएस करने के लिए परिवर्तनशील में सक्षम जीन, कम से कम एक उत्परिवर्ती द्वारा पहचाने जाते हैं एक पूरा विश्लेषण की अनुमति दृष्टिकोण है। हालाँकि, व्यवहार में, कई कारकों संतृप्ति के लिए दृष्टिकोण की सीमा। सबसे पहले, जबकि लगभग सभी जीनों उच्च तापमान पर गतिविधि के नुकसान के लिए उत्परिवर्तित जा सकता है, इस तरह के म्यूटेंट की वसूली की दक्षता भर में कम से कम बदलता हैपरिमाण ^7.8 के एक आदेश। इसलिए, एक यादृच्छिक स्क्रीन "अक्सर यात्रियों" लंबे समय से पहले संतृप्ति संपर्क किया है में आवर्तक हिट लेने के लिए शुरू होता है। दूसरा, जबकि टीएस म्यूटेशन आमतौर पर समारोह की कमी का परिणाम है, वे नहीं एक प्रतिबंधक तापमान पर सच nulls हो सकता है (इसके विपरीत और, अक्सर एक अनुमोदक के तापमान पर पूरी तरह से कार्य नहीं कर रहे हैं)। यह समस्या कई alleles की तुलना द्वारा कुछ हद तक निपटा जा सकता; अगर वे सब एक आम लक्षण प्रारूप का हिस्सा है, यह अधिक जीन की साधारण निष्क्रियता का परिणाम को प्रतिबिंबित करने की संभावना है। एकाधिक alleles भी प्रेरणा का घाव ¹ की निश्चित आणविक पहचान के लिए बहुत उपयोगी हैं। हालांकि, "लगातार उड़ाका" समस्या का मतलब शायद ही कभी मारा जीन में कई alleles ठीक करने के लिए मुश्किल हो सकता है।

इन कारणों के लिए, हम अलग और phenotypically टीएस म्यूटेंट को चिह्नित करने के लिए एक बढ़ाया पाइप लाइन विकसित किया गया है। हम 3,000 से अधिक टीएस म्यूटेंट एकत्र किया है अब तक, मैंके बारे में 200 नए उम्मीदवार कोशिका चक्र म्यूटेशन ncluding। इस संग्रह है, जो पहले से ही होने की संभावना सबसे अधिक या सभी सेल आवश्यक रास्ते में परिवर्तन भी शामिल है, की आणविक और प्ररूपी विश्लेषण संयंत्र कोशिका जीव विज्ञान में नए अंतर्दृष्टि और परिकल्पना प्रदान करना चाहिए। महत्वपूर्ण बात, इस पाइप लाइन के किसी भी सूक्ष्मजीव कि अगर पर बढ़ता कुशलता टीएस उत्परिवर्ती संग्रह का निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है।

उपकरण पर ध्यान दें: दो रोबोटों इस प्रक्रिया (एक कॉलोनी बीनने और एक संयोजन प्रतिकृति plater / चेरी बीनने) में दक्षता के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। Pickers आम तौर पर धातु पिन है। उठाया कालोनियों कुछ अवधि के लिए इन पिन पर हवा में आयोजित की जाती हैं (मिनट के लिए सेकंड, मॉडल पर निर्भर करता है)। Chlamydomonas हवा में एक धातु पिन पर के बारे में 20 सेकंड में मर जाता है। इस जीव के लिए मॉडल पसंद प्रतिबंधित। सटीकता मायने रखती है। हमारी कॉलोनी बीनने हद तक सही है; हालांकि, यह अपनी कार्रवाई में कुछ हद तक हिंसक है और स्प्रे आधारित पार संदूषण के लिए कुछ संभावना है। यह उच्च पर इस्तेमाल नहीं किया हैएर से 384 घनत्व (4.5 मिमी केंद्र-केंद्र रिक्ति); इस घनत्व, सटीकता पूरी तरह से स्वीकार्य है। प्रतिकृति चढ़ाना / चेरी उठा रोबोट (विभिन्न इन अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल संलग्नक) उठा पर बहुत धीमी है, लेकिन 1,536 घनत्व के लिए काफी सटीक (6,144 एक चुनौती है, यहां तक ​​कि यह बहुत ही सटीक रोबोट के लिए है, हम इस घनत्व का मूल्यांकन किया लेकिन नहीं चुने गए हैं इसकी वजह यह अपने विभिन्न कठिनाइयों का उपयोग करने के लिए)। रोबोट में अच्छी तरह से काम नहीं करेंगे, तो प्लेटें, असमान लोड कर रहे हैं आदि। यह यकीन है कि सही बातें हो रही हैं होने की स्पॉट जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है; बेशक, रोबोट पहुंच से बाहर चला जाएगा और सामान्य में, सब कुछ ठीक है, तो पहले कुछ प्लेटों सही थे जाना होगा।

Protocol

1. यूवी mutagenesis 200 Tris-एसीटेट फास्फेट (नल) के साथ आयताकार अगर प्लेट मध्यम 9,10 – 100 के एक बैच तैयार करें। इन प्लेटों को कुछ दिनों के लिए आगे तैयार है और अगले चरणों में निलंबित कर दिया कोशिकाओं का तेजी से अवशोषण सुनिश्चित करने के लिए सुखाने के लिए बेंच पर उन्हें रखने के लिए। प्रकाश के तहत तरल नल की 100 मिलीलीटर, 25 डिग्री सेल्सियस पर और 100 rpm पर मिलाते हुए, – संस्कृति Chlamydomonas कोशिकाओं अप करने के लिए 0.2 0.5 ऑप्टिकल घनत्व (~ 2 दिन आयुध डिपो 750)। नोट: Mat- Hygro आर (hygromycin बी करने के लिए प्रतिरोध प्रदान) और चटाई + पारो आर (Paromomycin के लिए प्रतिरोध प्रदान): यूवी mutagenesis दो आनुवंशिक पृष्ठभूमि में स्वतंत्र रूप से किया जाता है। एंटीबायोटिक विकल्प प्रदान की दो संभोग प्रकार के पूरक दवा रोधी होते हैं, मनमाना है। खुर्दबीन के नीचे संस्कृतियों में से प्रत्येक का एक नमूना जांच सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं व्यवहार्य, स्वस्थ (तैराकी और अक्षुण्ण), और प्रदूषण के बिना कर रहे हैं। नोट: ऊंचा हो गया संस्कृतियों "दुर्घटना" औरव्यवहार्यता खो देते हैं, "भूत" चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के रूप में दिखाई दे। एक प्रकार के बरतन संस्कृतियों जा रहा एक बार वे संतृप्ति तक पहुँचने मत रखना। "भूत" घटना 1.3 चरण में आसानी से पहचाने जा रहा है। 0.003 आयुध डिपो 750 संस्कृति पतला। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बोतल लपेटें समरूप घनत्व सुनिश्चित करने के लिए, के रूप में तनाव गतिशील है और प्रकाश के जवाब में directionally तैरती है। 600 उत्तरजीवी कालोनियों प्लेट (चित्रा 1) पर बनेगी – इतना है कि सेल की हत्या के लिए लेखांकन, 200, निलंबन की योजना बनाई यूवी खुराक के आधार पर के घनत्व को समायोजित करें। यूवी जोखिम बार के बारे में जानकारी के लिए 1 टेबल देखें। प्रदूषण को रोकने के लिए एक छोटे-ट्यूब कैसेट कि एक तरल निकालने की मशीन फिट बैठता देते हैं और नसबंदी के लिए washes की एक श्रृंखला प्रदर्शन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार,। एक 8 x 12 तरल निकालने की मशीन का उपयोग करना, प्रत्येक 2 μl के 4 x 96 बूंदों बांटना आयताकार प्लेट (चित्रा 1 पर </strong>)। प्लेट के किनारे पर हल्का ठोकर तरल पदार्थ की एक पतली शीट में सभी बूंदों के विलय को सुनिश्चित करने और तुरंत प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए प्लेटों को कवर करने के लिए। बहुत भी एकल कोशिका प्रसार सुनिश्चित करने के लिए, सूखी प्लेटों का उपयोग जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, और जल्दी से प्रकाश के जवाब में तैराकी से कोशिकाओं को रोकने के लिए प्लेटों को कवर किया। जब तक सभी तरल अवशोषित कर लेता है कवर प्लेटों के स्तर और अंधेरे में रखें। अनुभव से निर्धारित जीवित बचे लोगों के बीच ts- म्यूटेंट की एक इष्टतम उपज देने के लिए समय की अवधि के लिए एक कीटाणुनाशक यूवी दीपक (30 वाट कीटाणुनाशक यूवी ट्यूब) के नीचे प्लेटों रखें। 99.9% हत्या – 90 में परिणाम के लिए 50 सेमी – 40 की दूरी पर 1.5 मिनट – यहाँ, 0.5 के समय का उपयोग करें। 1,000 यूवी प्रेरित बिंदु उत्परिवर्तन, जिनमें से ~ 10% परिवर्तन कोडिंग दृश्यों – बचे 100 होते हैं। आदेश की मरम्मत 11,12, इस कदम पर अंधेरे में काम प्रकाश निर्भर डीएनए के कारण कोई प्रत्यावर्तन के साथ पराबैंगनी विकिरण की अधिकतम शक्ति को सुनिश्चित करने और तुरंत पैक करने मेंविकिरण के बाद एक अंधेरे बॉक्स में प्लेटें। कमरे के तापमान पर 24 घंटा – 8 के लिए अंधेरे में प्लेटों रखें। कालोनियों के रूप में रोशनी के साथ एक 21 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस। कॉलोनी गठन 10 दिनों ~ लेता है। प्लास्टिक बैग के साथ प्लेटों लपेट और तरल संक्षेपण दाग को अवशोषित कागज के अंदर जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें। वाष्पीकरण और संघनन चक्र अन्यथा तरल फिल्म मार्गों प्रदान कर सकते हैं contaminants प्लेटों में प्रवेश करने के लिए। रोबोट कॉलोनी उठा (चित्रा 2) के लिए स्रोत के रूप में प्रासंगिक ढेर में प्लेटें लोड। आयताकार प्लेटों पर 384 सरणियों के लिए कालोनियों उठाओ, और रोशनी (~ 1 सप्ताह) के साथ 21 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें विकसित। एक 1,536-सरणियों (4: 1) में 384 सरणियों गाढ़ा एक प्रतिकृति चढ़ाना रोबोट का उपयोग (चित्रा 3), और प्लेटें 21 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ~ 3 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। दो प्लेटों के लिए प्रत्येक 1,536-सरणियों दोहराने के लिए और 21 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक जगह (अनुमोदकतापमान) और एक 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (प्रतिबंधात्मक तापमान में अन्य)। 24 घंटा के बाद, पूर्व गर्म प्लेटों का एक नया सेट करने के लिए 33 डिग्री सेल्सियस में प्लेटों को दोहराने के लिए, और उन्हें 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह है। नोट: इस माध्यमिक चढ़ाना के लिए कारण भले ही चढ़ाना कोशिकाओं के बाद पहली सेल चक्र में गिरफ्तार कर लिया है, कि टीएस घातक म्यूटेंट में कुछ मामलों पर्याप्त बायोमास जमा कर सकते है। माध्यमिक प्रतिकृति यह संकेत समाप्त और बहुत संवेदनशीलता बढ़ जाती है। एक डिजिटल कैमरा 33 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 3 दिन और 21 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 5 दिनों के बाद साथ प्लेटों की तस्वीर। एक निश्चित सीमा में प्लेटों पकड़ो। एक "ग्रिड प्लेट" नौ संरेखण संकेतक है कि संस्कृति प्लेट (चित्रा 4) के साथ एक साथ फोटो खिंचवाने है के साथ चिह्नित का प्रयोग करें। बारी के रूप में तस्वीर संस्कृति प्लेटों 21 डिग्री सेल्सियस और 33 डिग्री सेल्सियस (21/33) छवियों बनती। नोट: विभिन्न ऊष्मायन बार विकास बराबर करने के बाद जंगली प्रकार काफी बढ़ता इस्तेमाल कर रहे हैं21 डिग्री सेल्सियस पर 33 से अधिक तेजी से डिग्री सेल्सियस पर। 2. टीएस उत्परिवर्ती उम्मीदवारों की पहचान: पहली बार परदे पृष्ठभूमि और एक 1,536 सरणी में खंड छवियों को समाप्त करने के लिए एक कस्टम मैटलैब छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ रखा 21/33 प्लेट छवियों की प्रक्रिया। कार्यक्रम प्रत्येक स्थिति (चित्रा 5) में पाया बायोमास (कुल पिक्सेल तीव्रता) का निर्धारण करेगा। नोट: (निर्देश के साथ एसआई में प्रदान की) सॉफ्टवेयर ग्रिड प्लेट छवि का उपयोग होगा इस्तेमाल बढ़ाई और प्लेट संरेखण में एक 1,536 सरणी में कोशिकाओं के स्थानों (व्यक्तिगत प्रविष्टियों) को निर्धारित करने और प्रत्येक कोशिका में कुल पिक्सेल तीव्रता गणना करने के लिए । (मुठ एस (मुठ 33) / एस (डब्ल्यूटी 33) / एस: प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए इन मूल्यों को तो समायोज्य मापदंडों के खिलाफ तुलना कर रहे हैं पर 21 डिग्री सेल्सियस के एक टीएस + मानक और तापमान संवेदनशीलता की डिग्री के सापेक्ष आवश्यक विकास को निर्धारित करने के लिए, के रूप में परिभाषित किया गया 21) / एस (डब्ल्यूटी 21), जहां एस संकेत में (पिक्सेल हैपृष्ठभूमि घटाव के बाद tensity), मुठ एक व्यक्ति उत्परिवर्ती है, और "गुम्मट" एक बेतरतीब ढंग से चुना गैर तापमान के प्रति संवेदनशील कॉलोनी (mutagenized तनाव था कि टीएस + phenotype) है। 21 डिग्री सेल्सियस पर विकास एस (मुठ 21) / एस (डब्ल्यूटी 21) के रूप में परिभाषित किया गया है। यह पहली स्क्रीन में, आराम चयन के मापदंड झूठी नकारात्मक दर कम रखने के लिए (21 डिग्री सेल्सियस पर अपेक्षाकृत कम वृद्धि और तापमान संवेदनशीलता की एक अपेक्षाकृत कम डिग्री अनुमति) लागू होते हैं। एकल कॉलोनी (आमतौर पर एक 384 सरणी में) रोबोटिक्स चुनने के लिए एक निर्देश फ़ाइल के रूप में सॉफ्टवेयर के द्वारा उत्पन्न चयनित कालोनियों की सूची लोड। रोबोटिक्स के निर्देशों के अनुसार स्रोत और लक्ष्य प्लेटों को तैयार है और सरणी के लिए कालोनियों (चित्रा 6) उठाओ। नोट: परम्परागत बीनने ऐसे .csv, .txt, या .xls के रूप में, कुछ प्रारूप में एक निर्देश फ़ाइल की आवश्यकता है। सभी बीनने क्षमता फ़ाइल पर ही आधारित होना होगा; विभिन्न स्वरूपों MATLAB कोड (बशर्ते स्रोत कोड) की मामूली संपादन की आवश्यकता होगी। </li> 21 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लक्ष्य प्लेटें प्लेस ~ 5 दिन एक शेयर की थाली से विकसित करने के लिए। 3. टीएस म्यूटेंट की पहचान: दूसरा स्क्रीन दोहराएँ 2.1 कदम उठाया कालोनियों जांचना। आमतौर पर 30 – कालोनियों के 50% के रूप में स्पष्ट टीएस lethals जांचना होगा, 2% की उपज के लिए – 5% टीएस lethals यूवी mutagenesis के जीवित रहने का प्रारंभिक कालोनियों के सापेक्ष। दो बार जांच टीएस lethals चुनने के लिए दोहराएँ 2.2 कदम है, लेकिन एक 384 घनत्व में आयताकार प्लेटों पर 100 कालोनियों के ब्लॉक में सरणी कालोनियों के लिए बनाया गया एक संशोधित निर्देश फ़ाइल के साथ। यह अगले चरण में सुविधाजनक सूक्ष्म परीक्षण के लिए है। निर्देश फ़ाइल प्रारूप MATLAB कोड द्वारा क्रम में निर्दिष्ट किया जाता है। एक नियंत्रण के रूप में कई गुम्मट कालोनियों में शामिल हैं और ~ 5 दिनों के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें जगह सुनिश्चित करें। 4. प्रारंभिक Phenotype निर्धारण 100-ब्लॉक 3.2 चरण में arrayed प्लेटों दोहराने के लिए और उन्हें 21 डिग्री सेल्सियस incu में जगहBator ~ 2 दिनों के लिए हौसले बढ़ रही कालोनियों प्राप्त करने के लिए। तीन प्रतियों के लिए 100 ब्लॉक प्लेट (4.1) की ताजा प्रतिलिपि को दोहराने। 21 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक प्रतिलिपि और एक नियंत्रण के रूप में 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। तीसरे प्रतिलिपि ( "प्लेटों स्क्रीनिंग") एक रोबोट सेटअप में रखें, और कालोनियों हाजिर लंबे पिन के साथ निष्फल पानी के साथ छुआ। नोट: Chlamydomonas कोशिकाओं अगर टिकी रोबोट कोशिकाओं के एक नहीं बल्कि घने स्थल के रूप में शुरू में देश के लिए, कुछ ही सूक्ष्म निरीक्षण के लिए उपलब्ध कोशिकाओं के साथ करते हैं। सूक्ष्म निरीक्षण के लिए कालोनियों का अनुकूलन करने के लिए, पानी की एक बूंद के साथ शुरू में स्थानांतरित कर कोशिकाओं स्पॉट (रोबोट लंबे पिन से स्थानांतरित कर पानी की मात्रा ~ 100 nl है)। यह एक छोटा सा त्रिज्या (~ 1 मिमी) प्रारंभिक लगाए केंद्र के बारे में कोशिकाओं के फैलाव में परिणाम कई पृथक एकल कक्षों के साथ। 0 समय स्क्रीनिंग प्लेटों के प्रत्येक स्थान के एक क्षेत्र के photomicrographs लो (जबकि अभी भी एकल, अविभाजित कोशिकाओं) (चित्रा 7) और ऊष्मायन के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों जगह है। एक संशोधित tetrad विच्छेदन माइक्रोस्कोप एक 384 घनत्व सरणी के 4.5 एमएम केंद्र के लिए केंद्र रिक्ति पर बंद हो जाता देने के लिए सेट के मैनुअल मंच नियंत्रण द्वारा छवि स्थान निर्धारित करते हैं। 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से स्क्रीनिंग प्लेटें निकालें और photomicrographs ले, कदम 4.4 में के रूप में, अलग-अलग समय बिंदुओं पर (10 घंटा, 20 घंटा, 48 घंटा)। यकीन मंच, थाली धारक, और मंच नियंत्रक करने के ठीक हर समय बिंदु में एक ही कोशिकाओं की छवियों को पाने के लिए calibrated हैं। त्वरित सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ अधिग्रहण (~ 10 मिनट) का प्रदर्शन। टीएस phenotype सत्यापित करने के लिए और यकीन है कि टीएस phenotype पर कोई बड़ा प्रभाव है कि छवि अधिग्रहण के दौरान तापमान के उतार चढ़ाव बनाने के लिए 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में दूसरे की नकल का प्रयोग करें। सूक्ष्म छवियों का विश्लेषण करें और म्यूटेंट वांछित मानदंडों के आधार पर (8 चित्रा) के लिए चयन करें। एक 96 arrayed अगर थाली में अंतिम चयनित सेट हाजिर। सुनिश्चित करें कि प्रत्येकप्लेट ही संभोग के प्रकार और दवा प्रतिरोध की म्यूटेंट शामिल हैं। प्रत्येक थाली के लिए, पिछले दो स्तंभों में एक सकारात्मक (क्वेरी उत्परिवर्तन) और एक नकारात्मक (डब्ल्यूटी) पूरक परख के लिए नियंत्रण शामिल। 5. पूरक और लिंकेज नई म्यूटेंट का परीक्षण करने के लिए "अक्सर यात्रियों" में नाइट्रोजन मुक्त युग्मक प्रेरण मध्यम से 10 arrayed कालोनियों की बड़ी राशि ट्रांसफर 96 अच्छी तरह से microplates (प्रत्येक कॉलोनी का घनत्व आयुध डिपो के आसपास 0.2 होना चाहिए)। ~ 5 घंटे के लिए – (20 डब्ल्यू पारा बल्ब 13) gametogenesis अनुमति देने के लिए प्रकाश के तहत प्लेटें सेते हैं। नोट: यह कदम एक नकल रोबोट सेटअप या स्वयं एक सरल चढ़ाना डिवाइस के साथ साथ या तो किया जा सकता है। विपरीत संभोग प्रकार gametogenesis के लिए नाइट्रोजन मुक्त युग्मक प्रेरण मध्यम 10 के साथ ट्यूबों में वैकल्पिक प्रतिरोध कैसेट को शरण देने के साथ प्रश्नों निलंबित। एक संभोग mixt में एक लक्ष्य थाली में नमूने मिश्रण20 μl (9 चित्रा) के Ure मात्रा। बाद ~ प्रकाश के तहत 10 मिनट, स्थान प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार से 5 μl: लिंकेज के परीक्षण के लिए एक नल प्लेट पर एक बार और एक बार नल पूरक के परीक्षण के लिए + 5 सुक्ष्ममापी पारो + 9 माइक्रोन के Hygro पर। 21 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर कड़ी प्लेटें सेते हैं, और फिर उन्हें पन्नी में लपेट। 5 दिनों के लिए अंधेरे में उन्हें रखने के zygospore गठन की अनुमति है। 21 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश में लिए पूरक परीक्षण प्लेटों 10 दिनों सेते ~। नोट: दवा मात्रा में दोगुना विषमयुग्मजी diploids के अस्तित्व के लिए अनुमति देने के लिए calibrated हैं, लेकिन वे अभी भी संभोग haploids को खत्म करने के लिए पर्याप्त हैं। इन राशियों मानक प्रतिरोध कैसेट इस विशेष परियोजना में इस्तेमाल एकीकरण के लिए calibrated किया गया; नई एकीकरण के साथ, खुराक recalibrated किया जाना चाहिए। अधिकांश बायोमास, से फ्लो (9 चित्रा) द्वारा diploids हो सत्यापित है हालांकि haploids (शायद अर्धसूत्रीविभाजन और दोगुना प्रतिरोधी के विकास से एक चर स्तरsegregants) आम तौर पर साथ ही साथ मनाया जाता है। ts- phenotype पहचान के लिए दो प्रतियों में पूरक परीक्षण प्लेटों को दोहराने। ~ 5 दिनों के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर 21 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रतिलिपि और एक प्रतिलिपि रखें। Ts- phenotype के लिए टेस्ट कालोनियों के रूप में 2.1 खंड (चित्रा 5) में वर्णित है। कालोनियों कि प्रश्न के साथ पूरक नहीं कर रहे हैं संभावना क्वेरी (diploids एक ही जीन में म्यूटेशन के लिए असमलैंगिक allelic) के रूप में एक ही जीन के alleles प्रतिनिधित्व करते हैं। लिंकेज के परीक्षण के लिए, कदम 5.4 निम्न, प्लेटें वापस प्रकाश को शिफ्ट ~ 7 दिनों के लिए अर्धसूत्रीविभाजन और अगुणित segregants के परिणाम की अनुमति है। नल + 10 माइक्रोन पारो और 10 माइक्रोन के Hygro करने के लिए कड़ी परीक्षण प्लेटों को दोहराने (, के बाद से कैसेट अनलिंक हैं अगुणित संतान के 25% होने की भविष्यवाणी) डबल-प्रतिरोधी संततियों के लिए चुन सकते हैं और एक सप्ताह के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ध्यान दें: दोगुना प्रतिरोधी haploids के लिए दवा की खुराक में वृद्धि। टेस्ट कालोनियों ts- phenotype के लिए, जैसा कि मैंनेn 2.1 कदम। नोट: एक ts- phenotype की उम्मीद है (और कहा) क्वेरी के रूप में ही पूरक समूह में म्यूटेंट के लिए। इसके अलावा, लिंकेज परख में एक ts- phenotype, एक उत्परिवर्ती कि क्वेरी पूरक के लिए, क्वेरी और नए उत्परिवर्तन के बीच तंग संबंध को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। म्यूटेंट कि परीक्षण प्रश्नों के पूरक संभावना नए जीन है कि आगे प्ररूपी विश्लेषण के लिए प्रेरणा का घाव के bioinformatic पहचान के लिए पाइपलाइन में प्रवेश करेंगे, और अंत में कर रहे हैं।

Representative Results

हम Chlamydomonas में टीएस म्यूटेंट को अलग-थलग करने के लिए एक त्वरित पाइपलाइन दिखा। प्रकोष्ठों अगर प्लेटों पर तिरस्कृत कर रहे हैं, और शीघ्र ही एकल कोशिका घनत्व के लिए माइक्रोस्कोप के तहत त्वरित सत्यापन के बाद, प्लेटें यूवी किरणित (चित्रा 1) कर रहे हैं। ठेठ विकिरणित कालोनियों की पहचान की है और एक अनुमोदक तापमान (चित्रा 2) में विकास के 10 दिनों के बाद एक arrayed प्रारूप में उठाया जाता है। 384 प्रारूप में परिणामी प्लेटें एक 1,536 सरणी (चित्रा 3) को विलय कर रहे हैं। किरणित कालोनियों इकट्ठा करने का ये पहला कदम से, हम arrayed है ~ 200,000 कालोनियों अब तक। 600 उत्तरजीवी कालोनियों प्लेटों पर बनेगी – निलंबन के घनत्व की योजना बनाई यूवी खुराक इतना है कि, मौत के लिए लेखांकन, 200 के आधार पर निकाला जाता है। तीन यूवी जोखिम बार (1.5 मिनट, 1 मिनट, और 0.5 मिनट) और तीन घनत्व के हिसाब से परीक्षण किया गया (तालिका 1)। अनुभव से, 1.5 मिनट जोखिम समय टीएस के सबसे झुकेंगे- म्यूटेंट (~ 50%); हालांकि, अब तक 1 मिनट सेल चक्र उम्मीदवारों के सबसे झुकेंगे। इसलिए, भविष्य यूवी mutagenesis दौर केवल 1 मिनट के साथ किया गया। एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय प्रारंभिक उठा और पार संक्रमण (विशेष रूप से उच्च घनत्व स्वरूपों में) के दौरान splashing है। यह दोहराव और एक ही उत्परिवर्ती के आगे phenotyping में दो बार हो सकता है। ऐसे परिदृश्य के लिए संभावना को कम करने के लिए, इष्टतम आकार में कालोनियों को इकट्ठा करने के ख्याल रखना है, और यकीन है कि आसन्न कालोनियों प्रारंभिक परख में उठाया नहीं कर रहे हैं। अगले दो अनुक्रमिक ts- phenotype assays (चित्रा 5) का प्रदर्शन किया गया था, और 3000 के आसपास ts- म्यूटेंट अलग थे और phenotypically समय चूक माइक्रोस्कोपी (8 चित्रा) से होती है। phenotypes कि कुछ मानदंडों को पूरा करने में रुचि की कोशिका चक्र के अध्ययन में जैविक ध्यान केंद्रित करने के कारण, हम जनरल प्रत्येक लक्ष्य में अधिक से अधिक दो alleles एकत्र करने में कोई दिलचस्पी नहीं हैई। इसलिए, हम नीचे की ओर पाइपलाइन (9 चित्रा) से अत्यधिक आवर्तक जीन को हटाने के लिए दो से अधिक alleles (क्वेरी) नव एकत्र उम्मीदवारों के खिलाफ साथ पहले से ही विशेषता जीन के साथ पूरक और लिंकेज परीक्षण किया। चित्रा 1: Unmutagenized प्रकोष्ठों और यूवी mutagenesis की वर्दी प्रसार। (क) 384 x 2 μl बूँदें एक अगर प्लेट एक अभिकर्मक निकालने की मशीन के प्रयोग पर तिरस्कृत कर रहे हैं। (ख) रैंडम प्लेटों माइक्रोस्कोप एकल कोशिका घनत्व को सत्यापित करने के तहत परीक्षण किया और एक 1 मिनट जोखिम के साथ विकिरणित यूवी कर रहे हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img alt="चित्र 2"src = "/ files / ftp_upload / 54831 / 54831fig2.jpg" /> चित्रा 2. यूवी mutagenized कालोनियों 384 सरणियों के लिए उठाया। (क) यूवी किरणित एकल कक्षों ~ के लिए दिखाई दे कालोनियों में 10 दिनों बड़े हो रहे हैं। स्केल बार = 2 सेमी। (ख) छवि विश्लेषण कार्यक्रम निश्चित मापदंडों के अनुसार वियोज्य कालोनियों को पहचानता है और रोबोट के लिए उन्हें 384 प्लेटों में arrays। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 1,536-सरणी के लिए 3. विलय चित्रा। चार 384 प्रारूप प्लेटें एक-1,536 थाली करने के लिए विलय कर रहे हैं; एक बार हो, वे ts- phenotype के लिए परीक्षण करने के लिए फिर से दोहराया है। एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण। चित्रा 4. मात्रा के लिए इमेजिंग। (क) प्लेट्स एक दस्तावेज फोटोग्राफी स्टैंड के तहत एक फ्रेम में आयोजित की जाती हैं, इसलिए है कि एक श्रृंखला में सभी प्लेटों समान बढ़ाई और स्थिति पर फोटो खिंचवाने कर रहे हैं। (ख) पहली छवि कोनों और midpoints पर रखा लाल डॉट्स के साथ एक 1536 अच्छी तरह से microtiter प्लेट की है। यह "ग्रिड प्लेट" छवि सरणी की स्थिति को परिभाषित करता है। (ग) ऊष्मायन के बाद एक 1,536 सरणी का उदाहरण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5. अर्ध द्वारा ts- phenotype की पहचानसे स्वचालित छवि विश्लेषण। प्लेट छवियों कस्टम MATLAB सॉफ्टवेयर (एसआई में प्रदान की) द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। छवि स्वचालित रूप से सेल सरणियों (96, 384, या 1,536) में खंडित है, और प्रत्येक कोशिका में संकेत मात्रा निर्धारित है। 21 डिग्री सेल्सियस पर विकास नीले रंग में चिह्नित है, और 33 डिग्री सेल्सियस पर विकास पीले रंग में चिह्नित है। 33 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 21 डिग्री सेल्सियस पर काफी अधिक विकास का प्रदर्शन कालोनियों का चयन किया और एक हरे रंग की बिंदी के साथ काले वर्गों में चिह्नित कर रहे हैं (टीएस + करने के लिए मानकीकृत)। इन विकल्पों मैन्युअल संपादित किया जा सकता है। अंतिम चयन कॉलोनी उठा रोबोट द्वारा इस्तेमाल के लिए एक फाइल करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 6 पहले दौर टीएस घातक उम्मीदवारों की रोबोट उठा। चेरी pickiएनजी रोबोट 2.1 चरण में वर्णित के रूप में एक नई सरणी के लिए उम्मीदवारों लेने के लिए उत्पन्न एक फ़ाइल से निर्देश के बाद। शीर्ष पैनल एक निष्फल पिन की लोडिंग से पता चलता है। नीचे पैनल स्रोत थाली में एक निश्चित कॉलोनी से सटीक उठा चलता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा टीएस घातक phenotypes की प्रारंभिक छंटाई के लिए 7. समय चूक स्क्रीनिंग। क्लोन है कि चित्रा 5 में सचित्र स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के दो दौर पारित एक सेल घनत्व कि इस तरह के व्यक्तिगत कोशिकाओं microscopically सुलझाया जा सकता है पर प्लेटों को दोहराया है। एक संशोधित tetrad विच्छेदन खुर्दबीन के पदों पर जो photomicrographs 0 घंटा, 10 घंटा, 20 और मानव संसाधन incubations एक के बाद लिया जाता है की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है टी 33 डिग्री सेल्सियस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 8 चित्रा: Chlamydomonas कोशिका चक्र म्यूटेंट समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा की पहचान की। (क) Chlamydomonas अद्वितीय सेल चक्र का चित्रण लंबे G1 चरण सेलुलर विकास की विशेषता, विखंडन एसएम चक्र है, जो नवजात बेटी कोशिकाओं के अंडे सेने के साथ खत्म द्वारा पीछा किया वर्णन करता है। (ख) सूक्ष्म छवियों सेल चक्र और ठेठ सेल चक्र म्यूटेंट कि बँटवारा को पूरा करने में विफल की पहचान के दौरान गुम्मट कोशिकाओं प्रदर्शित करता है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 9: पूरक और लिंकेज टेस्ट। (क) एक बार दोहराया उत्परिवर्तित जीन के साथ एक एंटीबायोटिक प्रतिरोधी (जैसे, hygro-) क्वेरी विपरीत संभोग प्रकार की म्यूटेंट कि एक दूसरे एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट (जैसे, पारो) बंदरगाह का एक सेट के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली में पार कर जाता है। पूरक प्लेटों diploids के उच्च अंश उपज के रूप में न्यूक्लिक एसिड धुंधला और प्रवाह cytometry में विश्लेषण (निचले बाएँ पैनल में) द्वारा दिखाया गया है। (ख) संभोग मिश्रण दोनों diploids में पूरक के लिए और डबल-प्रतिरोधी meiotic संतान में लिंकेज के लिए परीक्षण किया है। सकारात्मक नियंत्रण विपरीत संभोग प्रकार में क्वेरी ही है, और उम्मीद के रूप में, 33 डिग्री सेल्सियस पर ts- फेनोटाइप से पता चलता है, जबकि नकारात्मक नियंत्रण गुम्मट है और टीएस + phenotype पता चलता है। परिक्रमा कालोनियों क्वेरी के साथ कोई पूरक दिखाने के लिए और इसलिए कर रहे हैं nक्वेरी जीन के लिए ईडब्ल्यू ts- alleles। ये आम तौर पर, आगे के लक्षण वर्णन से बाहर रखा के बाद से ही "लगातार यात्रियों" पूरक परीक्षा सेट में कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। पहर आयुध डिपो कालोनियों उठाया (#) Ts- phenotype सेल चक्र उम्मीदवारों 1.5 ' 0.012 6000 (औसत = ~ 200) 200 (3.3%) 7 (3.5%) 1 ' 0.003 11,000 131 (1.19%) 15 (11.4%) (औसत = ~ 360) <टीडी rowspan = "2"> 0.5 ' 6E-04 9000 40 (0.45%) 1 (2.5%) (औसत = ~ 300) तालिका 1: विकिरण टाइम्स के कैलिब्रेशन कोशिका चक्र उत्परिवर्ती उम्मीदवारों की उपज को अधिकतम करने के लिए। तीन बार विकिरण इसी ओडीएस जीवित कॉलोनी संख्या (- 600 200) यह सुनिश्चित करने के साथ परीक्षण किया गया (प्रत्येक 30 प्लेटें)।

Discussion

पाइपलाइन यहाँ टीएस घातक म्यूटेंट के उच्च उपज अलगाव के लिए वर्णित है कि Chlamydomonas जीनोम का संभवतः सभी सेलुलर जरूरी रास्ते प्रतिनिधित्व कर रहे हैं सुनिश्चित करता है। दो संभावित सेल चक्र जीन की कुशल संग्रह के लिए और दोहराव "लगातार उड़ाका" alleles के उन्मूलन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: अधूरा सेल चक्र और 2) पहले से ही पहचान के खिलाफ समानांतर पूरक परख के लिए गिरफ्तारी phenotype विशेषताओं का 1) सुसंगत परिभाषा जीन क्वेरी नव पृथक लोगों के साथ संग्रह विस्तार करने के लिए।

जब प्रकाश अंधेरे चक्र से सिंक्रनाइज़, Chlamydomonas किसी भी डीएनए प्रतिकृति या कोशिका विभाजन के ¹³ दिन के उजाले घंटे के बिना और सेल आकार> 10x में वृद्धि के दौरान photosynthetically बढ़ता है। लगभग रात की शुरुआत के साथ संपाती, कोशिकाओं तो डीएनए प्रतिकृति, बँटवारा, और कोशिका विभाजन (8 चित्रा) बारी से कई चक्र से गुजरना। यह नियामक schemई मुख्य रूप से कोशिकाओं के विकास और अखंडता और कोशिका विभाजन चक्र के लिए विशेष रूप से आवश्यक जीन के लिए आवश्यक जीन के बीच एक प्राकृतिक गौरव प्रदान करता है। हमने पाया है 10 घंटा और 20 घंटे की समय अंक बहुत जानकारीपूर्ण के लिए एक प्रारंभिक किसी न किसी प्ररूपी में कटौती कर रहे हैं ¹ कि। टीएस घातक म्यूटेंट कि हम वर्तमान में पहचानते हैं, इन छवियों के आधार पर व्यापक वर्गों ¹ (Tulin और क्रॉस, 2014 में एसआई देखें), कर रहे हैं: पायदान, पॉपकॉर्न, गोल, लघु, मध्यम, जल्दी सेल, और कई चक्र (8 चित्रा )।

तीन सबसे प्रासंगिक श्रेणियों हम पर ध्यान केंद्रित पायदान, पॉपकॉर्न, और गोल कर रहे हैं। "पायदान" और "पॉपकॉर्न" phenotypes सबसे सेल चक्र विशेष घावों की विशेषता होने के लिए पहले से दिखाया गया है (जैसे, mitotic cyclin निर्भर kinase, डीएनए प्रतिकृति मशीनरी, और topoisomerase द्वितीय) ^1। एक (पायदान) या एकाधिक की उपस्थिति (पॉपकॉर्न) प्रारंभिक लेकिन असफल कोशिका विभाजन की स्पष्ट विमानों एक सुविधाजनक morphol हैसेल चक्र दीक्षा के ogical सूचक। इन म्यूटेंट आम तौर पर बहुत कम या कोई विकास दोषों का प्रदर्शन, 10 घंटे की निशान पर गुम्मट के समान सेल की मात्रा में वृद्धि के साथ। पायदान और पॉपकॉर्न phenotypes 10 घंटा में स्पष्ट कर रहे हैं और पूरी तरह से (अक्सर सेल के साथ जुड़े) विकसित कर रहे हैं 20 घंटा के द्वारा। "दौर" कोशिकाओं गुम्मट के लिए, लेकिन स्पष्ट प्रारंभिक विभाजन विमानों का बहुत कम उत्पादन के साथ इसी तरह से बढ़ती है, इस प्रकार बड़े, गोल गिरफ्तार कोशिकाओं से बेदखल। इस श्रेणी में पिछला म्यूटेंट microtubule समारोह (tubulin-तह सहकारकों, गामा ट्यूबिलिन अंगूठी जटिल) ¹ के लिए आवश्यक anaphase को बढ़ावा देने के जटिल ¹⁴ या में जीन के घटकों में गिर गया है। बाद में समय में, इन कोशिकाओं को अक्सर स्पष्ट सेल दिखा रहे हैं।

"छोटे" और "मध्यम" कोशिकाओं या तो negligibly (छोटा) या काफी कम हो जाना डब्ल्यूटी (मध्यम) से अधिक है। इन म्यूटेंट तिथि करने के लिए पहचान की कई जीनों जिसका एनोटेशन बुनियादी cellula में भूमिका का सुझाव में घावों हैआर विकास प्रक्रियाओं (अनुवाद या झिल्ली biogenesis)। (:;: कम माध्यम गुम्मट की तरह गोल) मध्यम और दौर के बीच मुख्य सूक्ष्म भेदभाव 10 घंटा में विकास की राशि पर टिकी हुई है। क्योंकि छोटे और मध्यम श्रेणी के लिए काफी बड़े हैं और शायद सेलुलर रास्ते की एक बड़ी रेंज में घावों प्रतिबिंबित करती हैं, हम इन श्रेणियों तर करने के लिए प्रयास नहीं कर रहे हैं; हालांकि, हम वर्ग के प्रतिनिधियों की पहचान विविध रास्ते में नुकसान के phenotypes समझने के लिए molecularly करना चाहते हैं। दो अशिक्षित श्रेणियां हैं: 1) जल्दी-lysing म्यूटेंट कि पहले सेल के विकास के कुछ सबूत और 2) कई चक्र के साथ 10 घंटे की निशान से अखंडता खोना (हरे रंग की हानि, refractility की हानि)। कोशिकाओं को इसी तरह पैदा करना 10 और 20 घंटा पर गुम्मट, हालांकि वे लंबी अवधि के प्रसार के लिए बाहर ले जाने के लिए एक पूर्ण अक्षमता दिखा रहे हैं।

हम ज्यादातर "पायदान," "पॉपकॉर्न," और "दौर" निस्र्पक रहे हैं और बाहर निकालने के लिए छोटे और मध्यम दौर कोशिकाओं, के रूप में अच्छी तरह सेके रूप में टपका हुआ म्यूटेंट कि पूरा कुछ कोशिका विभाजन। यह सुनिश्चित करना है कि इस तरह के विकास और झिल्ली अखंडता, के रूप में बुनियादी सुविधाओं सेलुलर, कार्य कर रहे हैं और विभाजन से संबंधित जीन के लिए संभावना को समृद्ध करने के लिए मुख्य रूप से है। यह दृष्टिकोण अनुभव से कुशल हो पाया है; हालांकि, यह हो सकता है कि एक सेल चक्र जीन pleiotropic है और G1 में पहले अतिरिक्त भूमिका है, वास्तविक विभाजन से पहले। इस तरह के मामलों में, जो हम दुर्लभ होने की उम्मीद है, याद कर रहे हैं। आम तौर पर, हम समरूप गिरफ्तारी, जो उच्च संभावना में होने के कारण करने के लिए एक प्रेरणा का उत्परिवर्तन एक पूरी तरह से बेकार प्रोटीन होता है वह यह है कि के लिए लक्ष्य। हालांकि, एक ही कारण के रूप में सिर्फ वर्णित के लिए, वहाँ कई गिरफ्तारी अंक हो सकता है और इसलिए, कुछ लचीलापन उम्मीदवारों के चयन में सलाह दी जाती है।

आदेश नव पहचान जीन के साथ संग्रह को समृद्ध करने के लिए, चुने हुए उम्मीदवारों पूरक के लिए यत्न कर रहे हैं। हम सकारात्मक नियंत्रण में ts- आवश्यकता नकारात्मक नियंत्रण में (क्वेरी उत्परिवर्तन के खिलाफ क्वेरी) और टीएस + (Querगुम्मट के खिलाफ y)। क्वेरी के रूप में एक ही पूरक समूह में नई म्यूटेंट ts- हैं। एक ही पूरक समूह में सदस्यता लगभग हमेशा एक ही जीन में एक आणविक घाव (इस तरह के हर जीन हम परीक्षण किया है के लिए मुकदमा किया गया है) को दर्शाता है। इसलिए, के लिए "अक्सर यात्रियों," इस कसौटी आगे लक्षण वर्णन के लिए अपवर्जनात्मक है। म्यूटेंट कि परीक्षण प्रश्नों के रूप में एक ही पूरक समूहों पर नहीं थे नए जीन के लिए उम्मीदवार हैं और आगे जैव सूचना विज्ञान और प्रायोगिक उपकरणों की विशेषता है। अलग-अलग समूहों में पूरक ts- alleles की अत्यधिक चर वसूली एक प्रसिद्ध घटना है कि है, परिवर्तनशीलता mutability विभिन्न जीनों के बीच ts- के महान आंतरिक परिवर्तनशीलता के कारण, पॉसों शोर से स्पष्ट रूप से अधिक है। आंतरिक मतभेद thermolability शामिल हो सकते हैं कारण बनता है; विभिन्न आकारों प्रोटीन; एक मोनोमर बनाम एक बड़े रूप में, जटिल स्थिर रूप में एक प्रोटीन की उपस्थिति; और mutagenic हॉट स्पॉट। यह लगभग एक शुद्ध nuisa हैnce। हालांकि, एक परिणामस्वरूप अनुकूल परिणाम है कि "लगातार उड़ाका" सूची (सूची के सबसे कब्जे में केवल कुछ ही लक्ष्य के साथ) लंबा नहीं है, इसलिए श्रम प्रधान पूरक परीक्षण परियोजना के बाद के चरणों में जब तक एक विशाल उपक्रम नहीं है।

एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हम एक कड़ी परख प्रदर्शन किया। इस परख में, डबल-प्रतिरोधी संततियों चुने गए हैं और ts- phenotype के लिए परीक्षण कर रहे हैं। एक ts- phenotype की उम्मीद (और कहा) क्वेरी के रूप में या कसकर जुड़े म्यूटेशन के लिए एक ही पूरक समूह में म्यूटेंट के लिए किया जाता है। परीक्षण किया जीनों में से प्रत्येक के लिए, एक गुम्मट संतान (टीएस + phenotype) आनुवंशिक दूरी के आधार पर एक निश्चित संभावना में प्रदर्शित होने की उम्मीद है। हम अनुमान है इन स्थानों में प्रत्येक संभोग के लिए करीब 100 zygospores देखते हैं कि। 100% meiotic दक्षता मान लिया जाये, इस एम के कारण लिंक रद्द दवा प्रतिरोध कैसेट से करीब 100 डबल-दवा प्रतिरोधी संतान (meiotic संतान के 25%, चार अर्धसूत्रीविभाजन प्रति, में परिणाम होगाendelian विरासत)। यह भी ts- म्यूटेशन, जहां संततियों के 25% डबल उत्परिवर्ती हो जाएगा के लिए इस मामले की जाएगी, और 25% WT होगा अगर क्वेरी और परीक्षण म्यूटेशन लिंक रद्द कर रहे हैं। इसलिए, डबल-दवा प्रतिरोधी संतान से बाहर, 25% डब्ल्यूटी (लगभग 25 कोशिकाओं) हो जाएगा। यह पूरी तरह से अनलिंक म्यूटेशन के लिए मामला है; हालांकि, मध्यम उठाना (~ 20 सेमी, के बारे में 2 एमबी, या जीनोम ¹¹⁵ के 2% के भीतर) दृढ़ता से कम या टीएस + संकेत को समाप्त होगा। एंटीबायोटिक कैसेट करने के लिए परीक्षण उत्परिवर्तन के संबंध के मामले में, टीएस + haploids कि डबल-दवा-प्रतिरोधी रहे हैं बहुत ही कम मात्रा में मौजूद हैं। यह पूरक सभी म्यूटेंट परीक्षण किया है, एक न्यायपालिका परिणाम है कि आसानी से उल्लेख किया, बावजूद परीक्षण सभी म्यूटेंट के साथ recombine को स्पष्ट विफलता के रूप में प्रकट होता है; ऐसे मामलों में, backcrossing समस्या का समाधान होगा।

पूर्व ज्ञान से और अनुक्रम विश्लेषण से दोनों में, हम Chlamydomonas में सेल चक्र जीन लगभग 500 जीनों ² होने की उम्मीद है, हालांकि मोअनुसूचित जनजाति, लेकिन शायद सभी नहीं, जरूरी है। हम अतिरिक्त म्युटाजेनेसिस राउंड के लिए आवश्यकता के रूप में अधिक म्यूटेंट एकत्र कर रहे हैं और संतृप्ति उगता के स्तर का मूल्यांकन करेंगे।

इस प्रक्रिया के अनोखे आवश्यक जैविक प्रक्रियाओं और जीन और प्रोटीन है कि उन्हें ले जाने के लिए बाहर के अध्ययन के लिए बनाया गया है। अन्य तरीके उत्पन्न करने के लिए आवश्यक जीन में अव्यवस्थाएं मौजूद हैं (जैसे, बेतरतीब ढंग से mutagenized alleles ^16, सशर्त लिखित alleles ^17, या hypomorphic alleles ¹⁸ के परिवर्तन)। हालांकि, वे सभी मुताबिक़ पुनर्संयोजन, जो दृढ़ता से वनस्पति Chlamydomonas में दबा दिया जाता है की आवश्यकता होती है। क्लस्टर, नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराने (CRISPR) / Cas9 प्रणाली जीन संशोधन ^{19 के} लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है; हालांकि, यह अभी तक Chlamydomonas ²⁰ में कुशलता से काम करने के लिए है। गंभीर, इन तरीकों में से सभी लक्ष्य के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता होती है। यह एक गंभीर प्रतिबंध हैएक संभावना यह कुछ नया सीखने के लिए है करने के लिए चाहता है! हमारा दृष्टिकोण आवश्यक जीन, किसी भी पूर्व ज्ञान की स्वतंत्र पहचान के म्यूटेशन निकलेगा। इसलिए, प्रौद्योगिकी के वर्तमान स्तर पर, गहरी अनुक्रमण द्वारा जीन की पहचान के द्वारा पीछा यादृच्छिक टीएस म्यूटेशन के अलगाव संयंत्र superkingdom में माइक्रोबियल कोशिका जीव विज्ञान में तेजी से प्रवेश पाने का सबसे कारगर तरीका हो सकता है।

प्रेरणा का म्यूटेशन की पहचान (से ~ 100 के बीच कोडिंग-अनुक्रम बदलते प्रत्येक क्लोन में म्यूटेशन) इस पत्र के दायरे से परे है। Bulked segregant पूल ¹ की गहरी अनुक्रमण प्रभावी लेकिन श्रम प्रधान है। उपभेदों की एक बड़ी संख्या में सभी म्यूटेशन के निर्धारण के लिए एक मिश्रित पूल रणनीति, पूल की एक छोटी संख्या अनुक्रमण के बाद, बहुत लागत और श्रम प्रभावी है। मिश्रित bulked segregant अनुक्रमण के लिए एक नई रणनीति के विकास के अंतर्गत है कि सिम म्यूटेंट के दर्जनों में प्रेरणा का म्यूटेशन की पहचान के लिए अनुमति देगाएक भी अनुक्रमण रन (तैयारी में) में ultaneously। इन क्षमता महत्वपूर्ण जीन की पहचान कदम म्यूटेंट कि यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं द्वारा ही संभव बनाया है बहुत तेजी से संचय के साथ तालमेल रखने के लिए अनुमति देने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं।

Materials

Equipment:
Hudson RapidPick colony picker	Hudson Robotics
MultiDrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small tube metal tip cassette	Thermo Scientific	24073295
Singer RotoR replica-plating robot	Singer Instruments		Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’)	Singer Instruments		Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials:
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7020