جيل من الفئران وحيدة النسيلة الأجسام المضادة بواسطة تقنية هجين
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
تقنية هجين الواردة في هذا البروتوكول وصفت لأول مرة من قبل كولر وميلشتاين 1 في عام 1975، وباستثناء بعض التحسينات التقنية، الإجراء الرئيسي لم يتغير بشكل كبير خلال السنوات ال 40 الماضية 2. والهدف من هذا البروتوكول هو شرح استراتيجية أكثر ملائمة للتحصين، طريقة موحدة لتوليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، ومثال لطريقة التحقق من صحة (ELISA).
الأجسام المضادة هي أدوات لا يصدق وتسهم في مجموعة واسعة من الأساليب التكنولوجية، مثل التدفق الخلوي، فرز الخلايا المغناطيسي، أو المناعي، فضلا عن خيارات التشخيصية والعلاجية لرصد وعلاج 3 المرض. وتتجلى التوافر التجاري من الاجسام المضادة للأهداف المرجوة من وجود أكثر من 24 قواعد بيانات الويب المختلفة مع كميات لا حصر لها تقريبا من الأجسام المضادة أو المنتجات ذات الصلة الأجسام المضادة 4. في عام 2015، لوكانت جزيئات ntibody جزءا من المناقشات الدولية 5-7 بسبب مشاكل خطيرة في التحقق من صحة الصحيح وتوصيف الأجسام المضادة المتاحة تجاريا.
ويمكن أن يكون صعبا ومكلفا للعثور على أجسام مضادة محددة للمستضد المستهدفة، وكثير من الأحيان، لم يكن لديهم تقارب أو خصوصية حاجة. على الرغم من توليد الأجسام المضادة لا تزال تستغرق وقتا طويلا ويتطلب الموظفين المهرة لتطوير والتحقق من صحة الأجسام المضادة، وإنتاج الأجسام المضادة بشكل فردي قد أفضل من شراء واحدة.
يرجع ذلك إلى حقيقة أن إنتاج الأجسام المضادة وتستغرق وقتا طويلا ويتطلب خبرة، وتطوير أساليب بديلة لإنتاج جزيئات ملزمة للتغلب على هذه المشاكل. الطريقة البديلة الأكثر شيوعا هو إنتاج المؤتلف من الأجسام المضادة سلسلة واحدة عن طريق عرض فج. يتم استخراج الجينات في المنطقة ملزمة متغير من الخلايا وجنبا إلى جنب مع البروتين طلاء من فج. لياليثم أعرب إنجل السلسلة على سطح الجراثيم وعرض في أكثر من بالغسل 8 خطوات. إنتاج الأجسام المضادة سلسلة واحدة هو أسرع قليلا، ولكنه يتطلب أيضا التجريبي المهرة. مساوئ بعض الأجسام المضادة سلسلة واحدة المؤتلف والاستقرار الفقراء وعدم صلاحيتها للتشخيص في المختبر. في معظم الاختبارات التشخيصية، ومستقبلات التيسير للكشف ضروري، والتي تحتاج إلى أن تضاف إلى الأجسام المضادة سلسلة واحدة المؤتلف بعد ذلك. مرة أخرى، وهذا هو مضيعة للوقت وأكثر تعقيدا من تقنية هجين. في التشخيص في المختبر، وقد أظهرت كامل طول وحيدة النسيلة الماوس والأرنب الأجسام المضادة ليكون أفضل خيار.
ويجب أن يتم واحدة من الخطوات الرئيسية في توليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة قبل العمل في المختبر يبدأ: تصميم immunoconjugate. الأسئلة التي تحتاج إلى التعامل معها هي: ما هو التكوين الجسمي لهدف في تطبيق و النهائيأيون، والتي المصفوفات هي موجودة؟ التي تركز فان الهدف يكون في التطبيق؟ ما هو التطبيق النهائي، وما هي الشروط التي يجب أن تتوفر الأجسام المضادة؟
تأخذ دائما بعين الاعتبار أنه إذا تم استخدام الببتيد شظية الخطي، كما أن لديها أن تكون خطية في حاتمة النهائية في الهدف من الاختيار؛ على خلاف ذلك، فإن الأجسام المضادة لا يلزم. وبطبيعة الحال، بغض النظر عن طريقة الفحص، يمكن اختيار الأجسام المضادة ليتعرف على تنسيقات مختلفة مولدة في تطبيقات مختلفة، ولكن هذا يجب أن يتم التحقق من صحة بدقة متناهية. هذه هي الأسباب التي تطور الأجسام المضادة والمصادقة عليها هي تلك العمليات الطموحة.
اختيار شكل الأنتيجين للتحصين أمر أساسي لتطوير الأجسام المضادة ويحدد نجاح أو فشل هذه العملية. وبمجرد أن الفئران تعبر عن الأجسام المضادة ذات الصلة، وعزل خلايا الطحال وتنصهر مع خلايا المايلوما. خطوط الخلايا المايلوما الأكثر شيوعا لالفئران تطوير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة هي X63-حج 8.653 9 و SP2 / 0-AG 14 10 من / ج الماوس سلالة BALB. الخلايا تنحدر من خبيث سرطان الغدد الليمفاوية الخلية البائية واختيرت لأنها لا تفرز أي من السلاسل الثقيلة أو الخفيفة الخاصة بها. الخلايا يمكن أن تتكيف مع نسبة بين 1:10 و 10: 1 (splenocytes مقابل خلايا الورم النقوي). في هذا البروتوكول، تم تكييف الخلايا إلى نسبة 3: 1 وتنصهر التي كتبها البولي ايثيلين جلايكول (PEG) والكهربائي، وفقا لStoicheva وهوى 11.
اندماج الخلايا البائية والخلايا المايلوما هو عملية عشوائية. لذلك، الهجينة من اثنين ب الخلايا الليمفاوية أو اثنين خلايا المايلوما يمكن أن تتولد، ولكن تلك الهجينة لن تكون قادرة على البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة في الثقافة. الخلايا الخضوع لاختيار هيبوزانتين، أمينوبترين، والثيميدين (HAT)، الذي فقط خلايا هجين تنصهر يمكن البقاء على قيد الحياة نظرا لإمكانية استخدام دي نوفو مسار تخليق بيريميدين. لتوليد مونالأجسام المضادة oclonal، فمن الضروري للحصول على خط الخلية التي تنشأ من خلية أم واحدة. يتم ضمان monoclonality عن طريق الحد من تقنيات التخفيف والتحليل المجهري للنمو الخلايا. يتم فحص وsupernatants ثقافة هجين لإنتاج الأجسام المضادة المحددة، ومعظمهم من ELISA أو قياس التدفق الخلوي، ويتم اختيار أفضل المواد اللاصقة. بعد الثقافة الجماهيرية وتنقية، ويمكن للجزيء الضد أخيرا أن توصف والتحقق من صحتها عن التطبيق المطلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
توليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من ورم هجين يتطلب تحليلا مكثفة ومفصلة حاتمة، وخاصة فيما يتعلق بتطبيق النهائي، عندما ينبغي أن تعترف الضد المستهدف. في كثير من الأحيان التقليل من شأنها من قبل المستخدمين ويؤدي إلى الأجسام المضادة مع ضعف الأداء. عملية الانصهار دائما…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
