Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
De hybridoma techniek die in dit protocol werd eerst beschreven door Köhler en Milstein in 1975 1 en, met uitzondering van enkele technische verbeteringen, de hoofdprocedure niet drastisch veranderd gedurende de laatste 40 jaar 2. Het doel van dit protocol is geschikter is immuniseringstrategie een standaardmethode voor het genereren van monoklonale antilichamen, en een voorbeeld van een validatie methode (ELISA) verklaren.
Antilichamen zijn ongelooflijk instrumenten en bijdragen aan een groot aantal technologische benaderingen zoals doorstroomcytometrie, magnetische celsortering, of immunofluorescentie, maar ook voor diagnostische en therapeutische toepassingen voor de ziekte volgen en behandelen 3. De commerciële beschikbaarheid van monoklonale antilichamen voor gewenste doelen wordt aangetoond door de aanwezigheid van meer dan 24 verschillende webdatabases bijna ontelbare hoeveelheden antilichamen of antilichaam gerelateerde producten 4. In 2015, eenntibody moleculen maakten deel uit van een internationale discussie 5-7 als gevolg van ernstige problemen in de juiste validatie en karakterisering van commercieel verkrijgbare antilichamen.
Het kan moeilijk en kostbaar zijn specifieke antilichamen voor een antigeen gerichte vinden vaak, hebben zij niet de affiniteit of specificiteit nodig. Hoewel het genereren van een antilichaam is nog steeds tijdrovend en vereist geschoold personeel te ontwikkelen en valideren van het antilichaam, het produceren van een antilichaam individueel misschien beter dan het kopen van een.
Vanwege het feit dat antilichaamproductie is tijdrovend en vereist ervaring, alternatieve werkwijzen voor de productie van bindende moleculen zijn ontwikkeld om deze problemen te overwinnen. De meest gebruikte alternatieve werkwijze is de recombinante productie van enkelketenige antilichamen via faagdisplay. De genen voor het variabele bindingsgebied worden uit cellen en gecombineerd met de coating proteïne van een faag. de single keten wordt vervolgens op het oppervlak van een bacteriofaag en gescreend in verschillende pannen 8 stappen. De productie van enkelketenige antilichamen iets sneller, maar het vereist ook een ervaren experimentator. De nadelen van bepaalde recombinante enkelketenige antilichamen slechte stabiliteit en een gebrek aan geschiktheid voor IVD. In de meeste diagnostische testen, een Fc-receptor voor detectie nodig, die moet later een recombinant antilichaam met enkele keten worden toegevoegd. Nogmaals, dit is tijdrovend en zelfs complexer dan de hybridoma techniek. In in vitro diagnostica zijn full-length muis en konijn monoklonale antilichamen is aangetoond dat de beste keuze.
Een van de belangrijkste stappen bij het genereren van monoklonale antilichamen moet gebeuren voor het werk in het lab begint: het ontwerp van het immunoconjugaat. Vragen die moeten worden aangepakt zijn: Wat is de fysische samenstelling van het doel in de finale Application, en welke matrices aanwezig? Welke concentratie zal de doelgroep bij de toepassing? Wat is de uiteindelijke toepassing, en wat zijn de eisen die het antilichaam moet voldoen?
Altijd rekening houden dat als een lineair peptide fragment wordt gebruikt, moet ook worden lineair in de laatste epitoop in het doel van keuze; anders zal het antilichaam binden. Natuurlijk, onafhankelijk van de screeningswerkwijze antilichamen kunnen worden geselecteerd om verschillende antigene formaten herkennen verschillende toepassingen, maar dit moet zeer nauwkeurig worden gevalideerd. Dit zijn de redenen waarom antilichaam ontwikkeling en validatie zijn dergelijke ambitieuze processen.
De keuze van de antigene format voor immunisatie is fundamenteel voor de ontwikkeling van antilichamen en bepaalt het succes of falen van dit proces. Zodra de muizen brengen een relevant antilichaam titer, worden de miltcellen geïsoleerd en gefuseerd met myelomacellen. De meest voorkomende myeloma cellijnen voormurine monoklonaal antilichaam ontwikkeling X63-Ag 8,653 9 en Sp2 / 0-Ag 14 10 van een Balb / c muizenstam. De cellen afstammen van een kwaadaardige B-cel lymfomen en werden geselecteerd omdat zij geen eigen zware of lichte ketens uitscheiden. De cellen kunnen worden aangepast om een verhouding tussen 1:10 en 10: 1 (splenocyten versus myelomacellen). In dit protocol werden de cellen aangepast om een verhouding van 3: 1 en gefuseerd door polyethyleenglycol (PEG) en elektrolas volgens Stoicheva en Hui 11.
De fusie van B-cellen en myeloma cellen een willekeurig proces. Daarom kan hybriden van twee B-lymfocyten of twee myeloomcellen worden geproduceerd, maar die hybriden zouden niet kunnen overleven lang in kweek. De cellen ondergaan een hypoxanthine, aminopterine en thymidine (HAT) selectie, waarbij alleen gesmolten hybridoomcellen overleven vanwege de mogelijkheid om de de novo route van pyrimidine synthese. Voor het genereren van Monoclonal antilichamen, is het nodig om een cellijn afkomstig uit een moedercel verkrijgen. De monoklonaliteit wordt gewaarborgd door beperkende verdunning technieken en de microscopische analyse van celgroei. De hybridoma kweeksupernatanten te screenen op specifieke antilichaamproductie, meestal door ELISA en doorstroomcytometrie en de beste bindmiddelen geselecteerd. Na massacultuur en zuivering, kan het antilichaammolecuul uiteindelijk gekarakteriseerd en gevalideerd voor de gewenste toepassing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het genereren van monoklonale antilichamen door hybridoma technologie vereist een intense en gedetailleerde analyse epitoop, vooral met betrekking tot de uiteindelijke toepassing bij het antilichaam de doelstelling moet herkennen. Dit wordt vaak onderschat door de gebruikers en leidt tot antilichamen met zwakke prestaties. Het fusieproces is altijd willekeurig, waardoor het resultaat van specifieke hybridoma's is sterk afhankelijk van de celverhouding en de vitaliteit op dit punt. Na beperkte verdunning, de cellen z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
