Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
Die Hybridom – Technologie in diesem Protokoll vorgestellt wurde zuerst von Köhler und Milstein 1 1975 beschrieben und mit Ausnahme von einigen technischen Verbesserungen hat die Hauptprozedur nicht dramatisch während der letzten 40 Jahre 2 geändert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine geeignetere Immunisierungsstrategie, eine Standardmethode zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, und ein Beispiel für eine Validierungsmethode (ELISA) zu erklären.
Antikörper sind unglaubliche Werkzeuge und tragen zu einer breiten Palette von technologischen Ansätzen, wie Durchflusszytometrie, magnetische Zellsortierung oder Immun sowie zu diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten für die Überwachung der Krankheiten und Behandlung 3. Die kommerzielle Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern für die gewünschten Ziele wird durch die Anwesenheit von mehr als 24 verschiedenen Web – Datenbanken mit fast unzähligen Mengen von Antikörpern oder Antikörper-verwandte Produkte 4 gezeigt. Im Jahr 2015 einntibody Moleküle waren Teil einer internationalen Diskussion 5-7 aufgrund schwerwiegender Probleme in der richtigen Validierung und Charakterisierung von im Handel erhältlichen Antikörpern.
Es kann schwierig und teuer sein, um spezifische Antikörper für eine gezielte Antigen zu finden, und oft haben sie nicht die Affinität oder Spezifität benötigt. Obwohl einen Antikörper zu erzeugen ist immer noch zeitaufwendig und erfordert qualifiziertes Personal um den Antikörper zu entwickeln und zu validieren, einen Antikörper einzeln produzieren könnte besser als ein Kauf.
Aufgrund der Tatsache, dass die Antikörperproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Erfahrung, alternative Verfahren zur Herstellung von Bindungsmolekülen wurden entwickelt, um diese Probleme zu überwinden. Die am häufigsten verwendete alternative Methode ist die rekombinante Herstellung von einkettigen Antikörpern mittels Phagen-Display. Die Gene für die variable Bindungsregion aus Zellen und in Kombination mit dem Beschichtungsprotein eines Phagen extrahiert. Die single Kette wird dann auf der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert und in mehreren Schritten Panning 8 gescreent. Die Herstellung von Einzelketten-Antikörper ist ein bisschen schneller, aber es erfordert auch ein erfahrener Experimentator. Die Nachteile einiger rekombinanter Einketten-Antikörper sind schlechte Stabilität und fehlende Eignung für die in vitro Diagnostik. In den meisten diagnostischen Tests, ein Fc-Rezeptor für die Detektion erforderlich ist, die anschließend zu einem rekombinanten Einketten-Antikörper zugegeben werden muss. Auch dies ist zeitaufwendig und sogar noch komplexer ist als die Hybridom-Technik. In In – vitro – Diagnostik, wurden in voller Länge monoklonalen Maus und Kaninchen – Antikörper zeigte die beste Wahl zu sein.
Einer der wichtigsten Schritte in der Herstellung monoklonaler Antikörper erzeugen, muss getan werden, bevor die Arbeit im Labor beginnt: das Design der Immunkonjugat. Fragen, die gelöst werden müssen, sind: Was ist die physikalische Zusammensetzung des Targets in der letzten applicat istIon, und die Matrizen vorhanden sind? Welche Konzentration wird das Ziel in der Anwendung? Was ist die letzte Anwendung, und was sind die Voraussetzungen, dass der Antikörper erfüllen muss?
immer berücksichtigen, dass, wenn ein lineares Peptidfragment verwendet wird, ist es auch in der endgültigen Epitop in der Zielwahl linear zu sein hat; andernfalls, binden die Antikörper nicht. Natürlich unabhängig von der Durchmusterungsverfahren, unterschiedliche antigenische Formate in verschiedenen Anwendungen zu erkennen Antikörper könnten ausgewählt werden, aber dies muss sehr genau überprüft werden. Dies sind die Gründe, warum der Antikörperentwicklung und Validierung sind solche ehrgeizigen Prozesse.
Die Wahl des Antigen-Format für die Immunisierung ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von Antikörpern und bestimmt den Erfolg oder das Scheitern dieses Prozesses. Nachdem die Mäuse einen entsprechenden Antikörpertiter exprimieren, werden die Milzzellen isoliert und mit Myelomzellen fusioniert. Die am häufigsten verwendeten Myelom-Zelllinienmurinen monoklonalen Antikörper Entwicklung sind X63-Ag 8.653 9 und Sp2 / 0-Ag 14 10 von einer Balb / c – Maus – Stamm. Die Zellen stammen von einem bösartigen B-Zell-Lymphom und wurden ausgewählt, weil sie alle ihre eigenen schweren oder leichten Ketten nicht absondern. 1 (Splenozyten gegen Myelomzellen): Die Zellen können zwischen 1:10 und 10 bis zu einem Verhältnis angepasst werden. 1 und verschmolzenen durch Polyethylenglykol (PEG) und Elektrofusion , gemäß Stoicheva und Hui 11: In diesem Protokoll wurden die Zellen in einem Verhältnis von 3 angepasst.
Die Fusion von B-Zellen und Myelomzellen ist ein Zufallsprozess. Daher Hybride von zwei B-Lymphozyten oder zwei Myelomzellen könnten erzeugt werden, aber diejenigen Hybride würde nicht für eine lange Zeit in Kultur überleben können. Die Zellen werden einer Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) Auswahl, nach dem nur fusionierten Hybridomzellen aufgrund der Möglichkeit der Verwendung der de novo – Weg der Pyrimidinsynthese überleben kann. Für die Erzeugung von monoclonal Antikörper ist es notwendig, eine Zelllinie Ursprung von einer Mutterzelle zu erhalten. Die Monoklonalität wird sichergestellt durch die Verdünnungstechniken begrenzen und die mikroskopische Analyse des Zellwachstums. Die Hybridom-Kulturüberstände werden auf spezifische Antikörperproduktion, meist durch ELISA gescreent oder Durchflusszytometrie, und die besten Bindemittel ausgewählt. Nach der Massenkultur und Reinigung kann schließlich das Antikörpermolekül charakterisiert und für die gewünschte Anwendung validiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern von Hybridoma-Technologie erfordert eine intensive und ausführliche Epitop-Analyse, insbesondere im Hinblick auf die endgültige Anwendung, wenn der Antikörper das Ziel erkennen sollte. Dies wird oft von den Benutzern unterschätzt und führt zu Antikörpern mit schwachen Leistungen. Der Fusionsprozess ist immer zufällig, was bedeutet, dass das Ergebnis der spezifischen Hybridomen auf das Zellverhältnis in hohem Maße abhängig ist und die Vitalität an dieser Stelle. Nach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
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