Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
Il IBRIDOMA presentato in questo protocollo è stato descritto da Köhler e Milstein 1 nel 1975 e, ad eccezione di alcuni miglioramenti tecnici, la procedura principale non è cambiata radicalmente nel corso degli ultimi 40 anni 2. Lo scopo di questo protocollo è quello di spiegare una strategia più appropriata di immunizzazione, un metodo standard per la generazione di anticorpi monoclonali, e un esempio di un metodo di convalida (ELISA).
Gli anticorpi sono strumenti incredibili e contribuiscono ad una vasta gamma di approcci tecnologici, come la citometria a flusso, l'ordinamento delle cellule magnetiche, o immunofluorescenza, nonché alle opzioni diagnostiche e terapeutiche per il monitoraggio e il trattamento della malattia 3. La disponibilità commerciale di anticorpi monoclonali per il target desiderato è dimostrata dalla presenza di oltre 24 diversi database web con quasi innumerevoli quantità di anticorpi o prodotti anticorpi legati 4. Nel 2015, unmolecole ntibody facevano parte di un dibattito internazionale 5-7 a causa di seri problemi in una corretta validazione e caratterizzazione di anticorpi disponibili in commercio.
Può essere difficile e costoso trovare anticorpi specifici per un antigene bersaglio, e spesso, non hanno affinità o la specificità necessaria. Sebbene generando un anticorpo è ancora tempo e richiede personale specializzato per sviluppare e convalidare l'anticorpo, producendo un anticorpo singolarmente potrebbe meglio di acquistare uno.
A causa del fatto che la produzione di anticorpi richiede tempo e richiede esperienza, metodi alternativi per la produzione di molecole di legame sono state sviluppate per superare questi problemi. Il metodo alternativo più comunemente usato è la produzione ricombinante di anticorpi a catena singola con phage display. I geni per la regione di legame variabile vengono estratti dalle cellule e combinati con la proteina di rivestimento di un fago. i scatena ingle viene espresso sulla superficie di un batteriofago e proiettato in diversi passaggi panning 8. La produzione di anticorpi a catena singola è un po 'più veloce, ma richiede anche un abile sperimentatore. Gli svantaggi di alcuni anticorpi a catena singola ricombinanti sono scarsa stabilità e la mancanza di idoneità della diagnostica in vitro. Nella maggior parte dei test diagnostici, un Fc-recettore per il rilevamento è necessario, che deve essere aggiunto ad un anticorpo a catena singola ricombinante dopo. Di nuovo, questo richiede tempo e ancora più complessa rispetto alla tecnica ibridoma. Nella diagnostica in vitro, full-length monoclonale di topo e di coniglio anticorpi sono stati dimostrato di essere la scelta migliore.
Uno dei principali passi nella generazione di anticorpi monoclonali deve essere fatto prima che il lavoro in laboratorio inizia: il disegno del immunoconiugato. Le domande che devono essere affrontate sono: Qual è la composizione fisica del bersaglio nella Applicat finaleione, e le cui matrici sono presenti? Quale concentrazione target avere nella domanda? Qual è l'applicazione finale, e quali sono i requisiti che l'anticorpo deve soddisfare?
Sempre tener conto che se viene usato un frammento peptidico lineare, deve anche essere lineare nel epitopo finale nella destinazione di scelta; altrimenti, l'anticorpo non si legherà. Naturalmente, indipendentemente dal metodo di screening, anticorpi potrebbero essere selezionati per riconoscere diversi formati antigenici in diverse applicazioni, ma devono essere convalidati molto preciso. Queste sono le ragioni per le quali lo sviluppo di anticorpi e la convalida sono tali processi ambiziosi.
La scelta del formato antigenica per l'immunizzazione è fondamentale per lo sviluppo di anticorpi e determina il successo o il fallimento di questo processo. Una volta che i topi esprimono un rilevante titolo anticorpale, le cellule di milza sono isolati e fusi con cellule di mieloma. Le linee cellulari di mieloma più comunimurino lo sviluppo di anticorpi monoclonali sono X63-Ag 8,653 9 e Sp2 / 0-Ag 14 10 da una / c ceppo di topi Balb. Le cellule discendono da un linfoma a cellule B maligni e sono stati selezionati perché non secernono qualsiasi delle loro catene pesanti e leggere. Le cellule possono essere adattati ad un rapporto compreso tra 1:10 e 10: 1 (splenociti contro cellule di mieloma). In questo protocollo, le cellule sono state adattate ad un rapporto di 3: 1 e fuse da polietilenglicole (PEG) e elettrofusione, secondo Stoicheva e Hui 11.
La fusione di cellule B e cellule di mieloma è un processo casuale. Pertanto, ibridi di due B linfociti o due cellule di mieloma potrebbero essere generati, ma questi ibridi non sarebbero in grado di sopravvivere per un lungo tempo di coltura. Le cellule subiscono una selezione ipoxantina, aminopterina e timidina (HAT), per cui solo le cellule di ibridoma fuse possono sopravvivere grazie alla possibilità di utilizzare il percorso de novo di sintesi delle pirimidine. Per la generazione di monanticorpi oclonal, è necessario ottenere una linea cellulare proveniente da una cellula madre. Il monoclonalità è garantita limitando le tecniche di diluizione e l'analisi microscopica della crescita cellulare. I sovranatanti di ibridoma sono proiettati per la produzione di anticorpi specifici, per lo più da ELISA o citometria a flusso, e le migliori leganti sono selezionati. Dopo cultura di massa e la purificazione, la molecola anticorpo può infine essere caratterizzata e convalidato per l'applicazione desiderata.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generazione di anticorpi monoclonali di IBRIDOMA richiede un'analisi intensa e dettagliata epitopo, soprattutto per quanto riguarda l'applicazione finale, quando l'anticorpo dovrebbe riconoscere il bersaglio. Questo è spesso sottovalutata dagli utenti e conduce agli anticorpi con prestazioni deboli. Il processo di fusione è sempre casuale, il che significa che il risultato di ibridomi specifici è fortemente dipendente dal rapporto cellulare e la vitalità a questo punto. Dopo diluizione limitata, le ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
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