Generering av monoklonale antistoffer fra mus ved Hybridoma Technology
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
Den hybridoma teknologi presenteres i denne protokollen ble først beskrevet av Kohler og Milstein en i 1975, og med unntak for noen tekniske forbedringer, har den viktigste prosedyren ikke endret seg dramatisk i løpet av de siste 40 årene 2. Formålet med denne protokollen er for å forklare en mer hensiktsmessig immunisering strategi, en standard metode for generering av monoklonale antistoffer, og et eksempel på en valideringsmetode (ELISA).
Antistoffer er utrolig verktøy og bidra til en lang rekke teknologiske metoder, som strømningscytometri, magnetisk cellesortering, eller immunofluorescens, samt diagnostiske og terapeutiske muligheter for sykdom overvåking og behandling tre. Den kommersielle tilgjengeligheten av monoklonale antistoffer til ønskede mål er demonstrert ved tilstedeværelsen av over 24 ulike nettdatabaser med nesten utallige mengder av antistoffer eller antistoff-relaterte produkter 4. I 2015, enntibody molekyler var en del av en internasjonal diskusjon 5-7 på grunn av alvorlige problemer i riktig validering og karakterisering av kommersielt tilgjengelige antistoffer.
Det kan være vanskelig og dyrt å finne spesifikke antistoffer for en målrettet antigen, og ofte har de ikke har affinitet eller spesifisitet nødvendig. Selv om det å generere et antistoff er fremdeles tidkrevende og krever faglært personell for å utvikle og validere antistoff, som produserer et antistoff individuelt kanskje bedre enn å kjøpe en.
På grunn av det faktum at antistoffproduksjon er tidkrevende og krever erfaring, ble alternative fremgangsmåter for fremstilling av bindingsmolekyler utviklet for å overvinne disse problemene. Den mest brukte alternativ fremgangsmåte er den rekombinante produksjon av enkeltkjede antistoffer via fag-display. Genene for de variable bindende region er ekstrahert fra celler og kombinert med belegget protein av en fag. de single kjeden blir deretter uttrykt på overflaten av en bakteriofag og vist i flere panning åtte trinn. Produksjon av enkeltkjede antistoffer er litt hurtigere, men det krever også en dyktig experimentalist. Ulempene ved enkelte rekombinante enkelt-kjedede antistoffer er dårlig stabilitet og en mangel på egnet for in vitro diagnostikk. I de fleste diagnostiske tester, er en Fc-reseptor for å påvise det er nødvendig, som må tilsettes til et rekombinant enkelt-kjede antistoff etterpå. Igjen, dette er tidkrevende og enda mer kompleks enn den hybridoma-teknikk. I in vitro diagnostikk, har full-lengde monoklonalt mus og kanin antistoffer vist seg å være det beste valget.
En av de viktigste trinnene i å generere monoklonale antistoffer må gjøres før arbeidet i laboratoriet begynner: utformingen av immunkonjugat. Spørsmål som må tas opp er: Hva er den fysiske sammensetningen av målet i finalen application, og som matriser er til stede? Hvilken konsentrasjon vil målet har i søknaden? Hva er den endelige søknaden, og hva er kravene at antistoff må oppfylle?
alltid ta hensyn til at dersom et lineært peptid-fragment som blir brukt, har det også å være lineær i den endelige epitop på det målet for valg; ellers vil antistoffet ikke binde. Selvfølgelig, uavhengig av screening-metoden, antistoffer kan bli valgt for å gjenkjenne ulike antigene formater i ulike anvendelser, men dette må valideres meget nøyaktig. Dette er årsakene til at antistoffutvikling og validering er slike ambisiøse prosesser.
Valget av antigen format for immunisering er grunnleggende for antistoffutvikling og avgjør suksess eller fiasko for denne prosessen. Når mus uttrykker et aktuelt antistofftiter blir miltcellene isolert og fusjonert med myelomceller. De mest vanlige myelom-cellelinjer formonoklonale antistoffer utvikling er X63-Ag 8,653 9 og Sp2 / 0-Ag 14 10 fra en Balb / c mus belastning. Cellene ned fra en ondartet B-celle lymfom og ble valgt fordi de ikke utskiller noen av sine egne tunge eller lette kjeder. Cellene kan tilpasses til et forhold mellom 1:10 og 10: 1 (splenocytter versus myelomceller). I denne protokollen, ble cellene tilpasset til et forhold på 3: 1 og fusjonert ved polyetylenglykol (PEG) og elektrosveising, i henhold til Stoicheva og Hui 11.
Den sammensmelting av B-celler og myelomceller er en tilfeldig prosess. Derfor er hybrider av to B-lymfocytter, eller to myelomceller kan genereres, men disse hybrider vil ikke være i stand til å overleve i lang tid i kultur. Cellene gjennomgå en hypoxantin, aminopterin, og tymidin (HAT) utvelgelse, ved hvilken bare sammensmeltede hybridoma-celler kan overleve på grunn av muligheten for å bruke de novo syntesen av pyrimidin syntese. For den generasjonen manoclonal antistoffer, er det nødvendig for å oppnå en cellelinje som stammer fra en mor celle. Den monoklonalitet sikres ved å begrense fortynningen teknikker og mikroskopisk analyse av cellevekst. De hybridomkultursupernatantene blir screenet for spesifikk antistoffproduksjon, for det meste ved hjelp av ELISA eller flowcytometri, og de beste bindemidler blir valgt. Etter massekultur og rensing kan antistoffmolekylet endelig være preget og validert for det ønskede programmet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering av monoklonale antistoffer ved hybridoma-teknologi krever en intens og detaljert analyse epitop, spesielt med hensyn til den endelige anvendelse, når antistoffet skal gjenkjenne målet. Dette er ofte undervurdert av brukere og fører til antistoffer med svake forestillinger. Fusjonsprosessen er alltid tilfeldig, noe som betyr at resultatet av spesifikke hybridomer er sterkt avhengig av det celle-forhold og vitalitet ved dette punktet. Etter begrenset fortynning, cellene er meget ustabil og krever stringent k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
