Генерация мышиных моноклональных антител с помощью гибридом технологии
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
Технология гибридомная , представленная в настоящем протоколе впервые был описан Келером и Мильштейн 1 в 1975 году , и, за исключением некоторых технических усовершенствований , за исключением того , основная процедура не сильно изменилась за последние 40 лет 2. Целью данного протокола является разъяснение более подходящей стратегии иммунизации, стандартный метод для генерации моноклональных антител, а также пример для метода проверки (ELISA).
Антитела представляют собой невероятные инструменты и внести свой вклад в широкий диапазон технологических подходов, таких как поточной цитометрии, магнитной сортировки клеток, или иммунофлюоресценции, а также для диагностических и терапевтических возможностей для контроля и лечения заболеваний 3. Коммерческой доступности моноклональных антител для желаемых целей свидетельствует наличие более чем 24 различных веб – баз данных с почти бесчисленные количества антител или продуктов антител , связанных с 4 -х . В 2015 годуntibody молекулы были частью международной дискуссии 5-7 из – за серьезных проблем в надлежащей проверки и определения характеристик коммерчески доступных антител.
Это может быть трудным и дорогостоящим, чтобы найти специфические антитела для целевого антигена, и часто, они не имеют сродства или специфичности необходимо. Несмотря на то, генерируя антитела по-прежнему отнимает много времени и требует квалифицированного персонала для разработки и проверки антитела, получения антитела по отдельности может лучше, чем покупать один.
В связи с тем, что продукция антител отнимает много времени и требует опыта, были разработаны альтернативные способы получения связывающих молекул, чтобы преодолеть эти проблемы. Наиболее часто используемым альтернативным методом является рекомбинантное получение одноцепочечных антител с помощью фагового дисплея. Гены вариабельной области связывания извлекаются из клеток и в сочетании с белком покрытия фага. В sIngle цепь затем экспрессируется на поверхности бактериофага и подвергают скринингу в нескольких панорамирование 8 шагов. Получение одноцепочечных антител немного быстрее, но он также требует квалифицированного экспериментатора. К недостаткам некоторых рекомбинантных одноцепочечных антител являются бедными стабильность и отсутствие пригодности для диагностики в лабораторных условиях . В большинстве диагностических тестов, ЯК-рецептор для обнаружения необходимо, которая должна быть добавлена к рекомбинантным одноцепочечных антител после этого. Опять же, это отнимает много времени и еще более сложным, чем техника гибридом. В диагностике в пробирке, полнометражные моноклональное мыши и антитела кролика были продемонстрированы быть лучшим выбором.
Одним из важнейших шагов в создании моноклональных антител должно быть сделано до того, как работа в лаборатории начинается: дизайн иммуноконъюгата. Вопросы, которые необходимо решить, являются: Каков физический состав мишени в конечном APPLICATиона, и где матрицы присутствуют? Какая концентрация будет иметь цель в приложении? Что такое окончательное приложение, и каковы требования, что антитело должен удовлетворять?
Всегда принимать во внимание, что если используется линейный пептидный фрагмент, он также должен быть линейным в конечном эпитоп в мишени выбора; в противном случае, это антитело не будет связываться. Конечно, независимо от метода скрининга, антитела могут быть выбраны, чтобы распознавать различные антигенные форматы в различных приложениях, но это должно быть подтверждено очень точно. Вот причины, почему антитела разработки и валидации являются такие амбициозные процессы.
Выбор антигенной формата для иммунизации имеет основополагающее значение для развития антител и определяет успех или неудачу этого процесса. После того, как мыши, проявляющие соответствующий титр антител, клетки селезенки выдел ют и сливают с клетками миеломы. Наиболее распространенные миеломы клеточные линии дляРазвитие мышиные моноклональные антитела являются X63-Ag 8,653 9 и Sp2 / 0-Ag 14 10 из / с мышиного штамма Balb. Клетки происходят от злокачественной лимфомы В-клеток, и были выбраны потому, что они не секретируют какие-либо из своих собственных тяжелой или легкой цепи. Клетки могут быть адаптированы к соотношении от 1:10 до 10: 1 (спленоциты в сравнении с клетками миеломы). В этом протоколе клетки были адаптированы к соотношении 3: 1 , и слитый с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и электросваркой, в соответствии с Stoicheva и Hui 11.
Слияние В-клеток и клеток миеломы является случайным процессом. Следовательно, гибриды двух В-лимфоциты или две клетки миеломы может быть сгенерирован, но эти гибриды не смогли бы выжить в течение длительного времени в культуре. Клетки проходят отбор гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT), в которой только слитые клетки гибридомы могут выжить из – за возможности использования De Novo пути синтеза пиримидинов. Для поколения пнoclonal антитела, необходимо, чтобы получить линию клеток, происходящих из одной материнской клетки. Моноклональности обеспечивается путем ограничения методов разрежения и микроскопический анализ клеточного роста. Супернатанты культуры гибридомы подвергают скринингу на специфических антител, в основном, с помощью ELISA или проточной цитометрии, и лучшие связующие выбраны. После массовой культуры и очистки, молекула антитела, наконец, могут быть охарактеризованы и утверждены для желаемого применения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генерирование моноклональных антител с помощью гибридомной технологии требует интенсивного и детального анализа антигенной детерминанты, в особенности в отношении конечного применения, когда антитело должно распознавать цели. Это часто недооценивается пользователей и приводит к а…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
