Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
La tecnología de hibridomas se presenta en este protocolo fue descrito por primera vez por Köhler y Milstein 1 en 1975 y, a excepción de algunas mejoras técnicas, el procedimiento principal no ha cambiado drásticamente durante los últimos 40 años 2. El objetivo de este protocolo es para explicar una estrategia más apropiada inmunización, un método estándar para la generación de anticuerpos monoclonales, y un ejemplo de un método de validación (ELISA).
Los anticuerpos son herramientas increíbles y contribuyen a una amplia gama de enfoques tecnológicos, tales como citometría de flujo, clasificación de células magnético, o de inmunofluorescencia, así como a las opciones diagnósticas y terapéuticas para el seguimiento y tratamiento 3 enfermedad. La disponibilidad comercial de anticuerpos monoclonales para los objetivos deseados se demuestra por la presencia de más de 24 diferentes bases de datos web con casi innumerables cantidades de anticuerpos o productos relacionados con anticuerpos 4. En 2015, unantibody moléculas eran parte de una discusión internacional 5-7 debido a serios problemas en la validación y caracterización de anticuerpos disponibles comercialmente correcta.
Puede ser difícil y costoso para encontrar anticuerpos específicos para un antígeno específico, y, a menudo, no tienen la afinidad o especificidad necesaria. A pesar de generar un anticuerpo es todavía mucho tiempo y requiere de personal capacitado para desarrollar y validar el anticuerpo, que produce un anticuerpo individualmente puedan mejor que comprar uno.
Debido al hecho de que la producción de anticuerpos es mucho tiempo y requiere experiencia, se han desarrollado métodos alternativos para la producción de moléculas de unión para superar estos problemas. El método alternativo más comúnmente utilizada es la producción recombinante de anticuerpos de cadena única a través de presentación en fagos. Los genes de la región variable de unión se extraen de las células y se combinan con la proteína de revestimiento de un fago. los scadena ingle se expresa entonces en la superficie de un bacteriófago y se tamiza en varios pasos paneo 8. La producción de anticuerpos de cadena única es un poco más rápido, pero también requiere un experimentador experto. Las desventajas de algunos anticuerpos de cadena simple recombinantes son una mala estabilidad y una falta de idoneidad para el diagnóstico in vitro. En la mayoría de las pruebas de diagnóstico, un Fc-receptor para la detección es necesario, que debe ser añadido a un anticuerpo de cadena sencilla recombinante después. De nuevo, esto es mucho tiempo y es aún más compleja que la técnica de hibridoma. En el diagnóstico in vitro, los anticuerpos monoclonales de ratón de longitud completa y de conejo se han demostrado ser la mejor opción.
Uno de los pasos más importantes en la generación de anticuerpos monoclonales se debe hacer antes de que el trabajo en el laboratorio a partir: el diseño del inmunoconjugado. Las preguntas que deben abordarse son: ¿Cuál es la composición física del objetivo en el último applicationes, y cuyas matrices están presentes? Cuya concentración será el objetivo de tener en la aplicación? ¿Cuál es la aplicación final, y cuáles son los requisitos que debe cumplir el anticuerpo?
Siempre tener en cuenta que si se utiliza un fragmento de péptido lineal, sino que también tiene que ser lineal en el epítopo final en la diana de elección; de lo contrario, el anticuerpo no se unirá. Por supuesto, independiente del método de selección, los anticuerpos podrían ser seleccionados para reconocer diferentes formatos antigénicos en diferentes aplicaciones, pero esto deben ser validados con mucha precisión. Estas son las razones por las cuales el desarrollo de anticuerpos y la validación son tales procesos ambiciosos.
La elección del formato antigénico para la inmunización es fundamental para el desarrollo de anticuerpos y determina el éxito o el fracaso de este proceso. Una vez que los ratones expresan un título de anticuerpos relevantes, se aíslan las células del bazo y se fusionan con células de mieloma. Las líneas celulares de mieloma más comunes parael desarrollo de anticuerpos monoclonales murinos son X63-Ag 8.653 9 y Sp2 / 0-Ag 14 10 de un / c cepa de ratón Balb. Las células descienden de un linfoma de células B malignas y se seleccionaron debido a que no secretan cualquiera de sus propias cadenas pesadas o ligeras. Las células pueden adaptarse a una relación de entre 1:10 y 10: 1 (esplenocitos frente a las células de mieloma). En este protocolo, las células se adaptan a una proporción de 3: 1 y se fusionan por polietilenglicol (PEG) y electrofusión, de acuerdo con Stoicheva y Hui 11.
La fusión de las células B y las células de mieloma es un proceso aleatorio. Por lo tanto, los híbridos de dos B linfocitos o dos células de mieloma se podrían generar, pero los híbridos que no serían capaces de sobrevivir durante un largo tiempo en cultivo. Las células se someten a una selección de hipoxantina, aminopterina, y timidina (HAT), mediante el cual sólo las células de hibridoma fusionadas pueden sobrevivir debido a la posibilidad de utilizar la vía de novo de la síntesis de pirimidina. Para la generación de lunoclonal anticuerpos, es necesario obtener una línea celular procedente de una célula madre. El monoclonalidad se garantiza mediante la limitación de las técnicas de dilución y el análisis microscópico de crecimiento celular. Los sobrenadantes del cultivo de hibridoma se criban para la producción de anticuerpos específicos, principalmente por ELISA o citometría de flujo, y los mejores aglutinantes se seleccionan. Después de la cultura de masas y la purificación, la molécula de anticuerpo, finalmente, se puede caracterizar y validado para la aplicación deseada.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generación de anticuerpos monoclonales mediante tecnología de hibridoma requiere un análisis intenso y detallado epítopo, especialmente con respecto a la aplicación final, cuando el anticuerpo debería reconocer el objetivo. Esto es a menudo subestimada por los usuarios y conduce a los anticuerpos con los pobres resultados. El proceso de fusión es siempre aleatorio, lo que significa que el resultado de hibridomas específicos es altamente dependiente de la relación de células y la vitalidad en este punto. Des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
