Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
Bu protokol sunulan hibridoma teknolojisi ilk Köhler ve 1975 yılında Milstein 1 tarafından tarif edilmiştir ve bazı teknik iyileştirmeler dışında, ana prosedür son 40 yıl 2 sırasında önemli ölçüde değişmedi. Bu protokolün amacı, daha uygun bir aşı stratejisi, monoklonal antikorların üretilmesi için standart bir yöntem ve bir doğrulama yöntemi (ELISA) için bir örnek açıklamaktır.
Antikorlar inanılmaz araçlar ve hastalık izleme ve tedavi 3 tanı ve tedavi seçenekleri yanı sıra, bu tür flow sitometri, manyetik hücre sıralama, ya da immünofloresan gibi teknolojik yaklaşımlar, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. İstenilen hedeflere yönelik monoklonal antikorların, ticari uygunluk antikorlar veya antikor-ilgili ürünlerin 4 yaklaşık sayısız miktarlarda 24 farklı bir web veri tabanları varlığı ile ortaya konmuştur. 2015 yılında, birntibody moleküller nedeniyle uygun doğrulama ve piyasada mevcut antikorların karakterizasyonu ciddi sorunlara uluslararası bir tartışmanın 5-7 parçasıydı.
Hedef bir antijen için spesifik antikorları bulmak zor ve pahalı olabilir, ve genellikle, bu afinite ve özgüllük gerekli bulunmamaktadır. Bir antikor üreten hala zaman alıcı ve kudret daha iyi bir satın alma daha ayrı bir antikor üreten, geliştirmek ve antikor doğrulamak için kalifiye personele ihtiyaç duyar rağmen.
Nedeniyle antikor üretimi zaman alıcıdır ve deneyim gerektirir olması, bağlama moleküllerinin üretimi için alternatif yöntemler, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan alternatif bir yöntem, faj gösterimi ile, tek zincirli antikorların rekombinant üretimi. Değişken bağlayıcı bölge genleri hücrelerinden ekstre edilmiş ve bir faj kaplama proteini ile bir araya getirilmektedir. sIngle zinciri daha sonra bakteriyofaj yüzeyi üzerinde ifade edilir ve birden fazla kaydırma adımda 8 taranır. Tek zincirli antikorların üretimi daha hızlıdır, ancak, aynı zamanda, bir uzman deneye gerektirir. Bazı biraraya getiren tek zincirli antikorların dezavantajları kötü istikrar ve in vitro diagnostik için uygunluk eksikliği vardır. En tanısal testlerde, saptama için bir Fc-reseptörü sonradan yeniden birleştirici tek zincirli antikor eklenmesi ihtiyacı olan gereklidir. Yine, bu zaman alıcı ve hibridoma tekniği daha fazla karmaşıktır. In vitro diagnostik, tam uzunlukta monoklonal fare ve tavşan antikorları en iyi seçenek olarak gösterilmiştir.
immüno tasarımı: laboratuarda çalışma başlamadan önce monoklonal antikorların üretilmesi önemli adımlardan biri yapılmalıdır. ele alınması gereken sorular şunlardır: Nihai applicat hedefin fiziksel kompozisyonu nediriyonu ve mevcut olduğu matrisler? hedef uygulamada hangi konsantrasyon olacak? Nihai uygulama nedir ve antikor yerine getirmesi gerektiğini istenenler nelerdir?
Her zaman doğrusal bir peptid fragmanı kullanıldığı takdirde, aynı zamanda seçim hedefi nihai epitop doğrusal gerektiği dikkate almak; aksi halde, bir antikor bağlamayacaktır. Tabii ki, tarama yönteminin, bağımsız olarak, antikorlar, farklı uygulamalarda farklı antijenik biçimleri tanıyan seçilebilir, ancak bu çok kesin doğrulanması gerekir. Bu antikor geliştirme ve doğrulama gibi iddialı süreçlerdir nedenleri vardır.
bağışıklama için antijenik biçimi seçimi antikor gelişimi için esastır ve bu sürecin başarısını veya başarısızlığını belirler. farenin ilgili bir antikor titresi ifade sonra, dalak hücreleri izole edildi ve miyeloma hücreleri ile birleştirilmiştir. En sık miyeloma hücre çizgilerifare monoklonal antikor gelişimi X63-Ag 8,653 9 ve Balb / c fare suşundan SP2 / 0-Ag 14 10 vardır. Hücreler malign B hücre lenfoması soyundan ve kendi ağır veya hafif zincirlerinin bir salgılar çünkü seçilmiştir. 1 (miyelom hücreleri karşı splenositler): hücreler 1:10 ile 10 arasında bir oranda uyarlanabilir. Stoicheva Hui 11'e göre, 1 ve polietilen glikol (PEG) ve elektrofüzyon ile kaynaşık: Bu protokol, hücrelerin 3 bir oranda uyarlanmıştır.
B hücreleri ve miyelom hücrelerinin füzyonu rasgele bir süreçtir. Bu nedenle, iki B lenfositleri ya da iki miyelom hücrelerinin hibridlerinin oluşturulmasına olabilir, ancak bu melez kültürde uzun süre hayatta mümkün olmaz. Hücreleri sadece kaynaşık hibridoma hücreleri nedeniyle pirimidin sentezi de novo yolu kullanan olasılığı dayanabildiği bir hipoksantin, aminopterin ve timidin (HAT) seçimi, tabi tutulur. mon üretimi içinoclonal antikorlar, bir ana hücreden kaynaklanan bir hücre çizgisi elde etmek için gereklidir. monoklonalitenin seyreltme teknikleri ve hücre büyümesinin mikroskobik analizi sınırlayarak sağlanır. hibridom kültür süpernatantları çok ELISA ile spesifik antikor üretimi için ya da akış sitometrisi, ve en iyi bağlayıcılar seçilebilirler. kitle kültürü ve saflaştırmadan sonra, antikor molekülü son karakterize edilebilir ve arzu edilen uygulama için doğrulandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorların üretimi, antikor hedefi kabul ne zaman, özellikle de son uygulama ile ilgili olarak, yoğun ve ayrıntılı epitop analizi gerektirir. Bu genellikle kullanıcılar tarafından hafife ve zayıf performansları ile antikorlara neden olmaktadır. Füzyon işlemi spesifik hibridomlar sonucu bu noktada hücre oranı ve canlılık üzerine son derece bağlı olduğu anlamına gelir, her rastgele. Sınırlı seyreltildikten sonra, hücreler, çok dengesizdirler ve hücre bü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
