Observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
Een methode voor de waarneming en kwantificeren van het paargedrag van het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus, werd opgericht in het kader van een stereomicroscoop. De paring efficiëntie van B. Xylophilus verbeteren en de kans op paring observatie te vergroten, maagdelijk volwassenen werden gekweekt en gebruikt voor het onderzoek. Eieren werden verkregen door het houden van de aaltjes in het water en het toestaan van de vrouwtjes om eieren te leggen gedurende 10 min. De tweede fase juvenielen (J2) werden gesynchroniseerd door het incuberen van de eieren voor 24 uur bij 25 ° C in het donker, en het begin J4 werden verkregen door het kweken van de J2 met grijze schimmel, Botrytis cinerea, nog eens 52 uur. Op dit tijdstip konden de meeste J4 nematoden duidelijk onderscheiden als zijnde mannelijke of vrouwelijke genitale behulp van hun morfologie. De mannelijke en vrouwelijke J4 werden verzameld en gekweekt in twee afzonderlijke Petrischalen voor 24 uur tot maagdelijke volwassen nematoden krijgen. Een maagd mannelijke en een vrouwelijke maagd werden gekoppeld in een druppel water in de put van een concave slide. Het paringsgedrag werd gefilmd met een videorecorder onder een stereomicroscoop. De gehele duur van de paring proces was 82,8 ± 3,91 min (gemiddelde ± SE) en kan worden opgedeeld in 4 verschillende fasen: zoeken, contact op te nemen, copuleren, en slepende. De gemiddelde notulen van duur waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 en 7,2 ± 0,5, respectievelijk. Elf sub-gedragingen werden beschreven: het kruisen, het naderbij komen, ontmoeten, aanraken, hooping, het opsporen, het bevestigen, ejaculeren, het scheiden, rust, en roaming. Interessant, werd duidelijk intraseksueel concurrentie waargenomen wanneer een vrouwtje was gegroepeerd met 3 mannen of een man met 3 vrouwen. Dit protocol is nuttig en waardevol, niet alleen bij het onderzoek het paringsgedrag van B. xylophilus, maar ook als een referentie voor ethologische studies van andere nematoden.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behavioral tests zijn een fundamenteel aspect van de chemische ecologie, neurobiologie, moleculaire biologie en genetica. Nematoden, met name C. elegans, worden veelvuldig gebruikt voor onderzoek op dit gebied. Het paargedrag van C. elegans is eerder 10-11 onderzocht. Echter, B. xylophilus gonochoristic en verschillend van de tweeslachtige C. elegans en de paring heeft verschillende gedragskenmerken 9. Onlangs heeft het paargedrag van Bursaphelenchus okinawae…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Zhu en Liqun Bai eveneens bijgedragen aan dit werk. Dit werk werd financieel ondersteund door het speciaal fonds voor de bosbouw Wetenschappelijk Onderzoek in het algemeen welzijn (201204501) en de National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688 en 31570638). Wij danken Dr. Holighaus Gerrit en Dr. Danielle Hickford voor hun nuttige suggesties over Engels schrijven.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen’s mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R. Male mating behaviour. The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
