Наблюдение и Количественное брачного поведения в Pinewood нематоды,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
Способ наблюдения и количественной оценки поведения сопряжении сосновой нематоды, Bursaphelenchus xylophilus, был создан под стереомикроскопа. Для повышения эффективности спаривания B. Xylophilus и увеличить шансы наблюдения спаривания, девственные взрослые культивировали и использовали для исследования. Яйца были получены путем держать нематод в воде и позволяя самки откладывают яйца в течение 10 мин. Молодь второго этапа (J2) были синхронизированы путем инкубирования яиц в течение 24 ч при 25 ° C в темноте, и в начале Д4 были получены культивированием J2 с серой гнили, Botrytis сшегеа, еще 52 ч. В этот момент времени, большинство J4 нематоды может быть четко отличать как мужского или женского пола с использованием их половых морфологии. Мужского и женского пола J4 собирали и культивировали отдельно в двух разных чашках Петри в течение 24 ч, чтобы получить девственные взрослых нематод. Девственница самец и самка девственницей были соединены в капле очистэр в скважине вогнутого ползуна. Брачное поведение было снято с видеомагнитофоном под стереомикроскопа. Весь период процесса спаривания был 82,8 ± 3,91 мин (среднее значение ± SE) и может быть разделен на 4 этапа: поиск, контактирующих, совокупляющихся и сохраняющиеся. Средние минуты продолжительности были 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 и 7,2 ± 0,5, соответственно. Одиннадцать суб-модели поведения были описаны: крейсерская, приближаясь, сталкиваясь, прикасаясь, Hooping, размещение, установка, эякуляцию, отделяя успокоенность, и роуминг. Интересно, что наблюдалось очевидное внутри половой конкуренции, когда одна женщина была сгруппирована с 3-х самцов или одного самца с 3-х самок. Этот протокол является полезным и ценным, а не только при исследовании брачного поведения Б. xylophilus, но и выступает в качестве эталона для этологических исследований других нематод.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поведенческие тесты являются одним из основных аспектов химической экологии, нейробиологии, молекулярной биологии и генетики. Нематоды и , в частности С. Элеганс, широко используются для исследований в этих областях. Поведение спаривание С. Элеганс было исследовано ранее 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Чжу и Лицюнь Бай внесли одинаковый вклад в эту работу. Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Специального фонда для лесного хозяйства научных исследований в социальной защиты населения (201204501) и Национального фонда естественных наук Китая (31170604, 31270688 и 31570638). Мы благодарим доктора Holighaus Герритом и д-р Даниэль Hickford за их полезные предложения по английскому письменной форме.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen’s mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R. Male mating behaviour. The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
