La observación y cuantificación de la conducta de apareamiento en el nematodo del pino,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
Un método para observar y cuantificar el comportamiento de apareamiento del nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus, se estableció bajo un microscopio estereoscópico. Para mejorar la eficiencia de acoplamiento de B. Xylophilus y para aumentar las posibilidades de observación de apareamiento, los adultos vírgenes se cultivaron y se utilizan para la investigación. Los huevos se obtuvieron manteniendo los nematodos en agua y permitiendo que las hembras ponen huevos para 10 min. Los juveniles de segunda etapa (J2) se sincronizaron mediante la incubación de los huevos durante 24 horas a 25 ° C en la oscuridad, y la temprana J4 se obtuvieron por cultivo de la J2 con el moho gris, Botrytis cinerea, por otra 52 h. En ese momento, la mayoría de los nematodos J4 podían distinguirse claramente como ser hombre o mujer usando su morfología genital. La hembra J4 macho y se recogieron y se cultivaron por separado en dos placas de Petri diferentes para 24 h para obtener nematodos adultos vírgenes. Un macho y una hembra virgen virgen fueron emparejados en una gota de water en el pozo de una diapositiva cóncava. El comportamiento de apareamiento fue filmado con un grabador de vídeo bajo un microscopio estereoscópico. todo el período del proceso de apareamiento fue del 82,8 ± 3,91 min (media ± DE) y se puede dividir en 4 fases distintas: la búsqueda, contacto, copulando, y persistentes. La media de minutos de duración fueron 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 y 7,2 ± 0,5, respectivamente. Se describen once sub-comportamientos: crucero, se acerca, el encuentro, tocando, zunchado, la localización, adjuntando, eyacular, la separación, la quietud, y la itinerancia. Curiosamente, se observó obvia la competencia intra-sexual cuando una mujer se agrupó con 3 machos o un macho con 3 hembras. Este protocolo es útil y valiosa, no sólo en la investigación del comportamiento de apareamiento de B. xylophilus, sino también en que actúa como referencia para los estudios etológicos de otros nematodos.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pruebas de comportamiento son un aspecto fundamental de la ecología química, la neurobiología, la biología molecular y la genética. Nematodos, y en particular de C. elegans, se usan ampliamente para estudios en estas áreas. El comportamiento de apareamiento de C. elegans se ha investigado previamente 10-11. Sin embargo, B. xylophilus es gonochoristic y diferente de los hermafroditas C. elegans, y su proceso de apareamiento tiene diferentes características de comporta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Zhu y Liqun Bai contribuyeron igualmente a este trabajo. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Fondo Especial para la Investigación Científica Forestal en el Bienestar Público (201204501) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31170604, 31270688, 31570638 y). Agradecemos al Dr. Gerrit Holighaus y el Dr. Danielle Hickford por sus útiles sugerencias sobre la escritura Inglés.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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