Summary
mitochondries des cellules endothéliales sont critiques pour maintenir l'intégrité hémato-encéphalique barrière. Nous introduisons un protocole pour mesurer la fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux.
Abstract
L'intégrité du sang-cerveau-barrière (BBB) est essentielle pour prévenir les lésions cérébrales. endothélial vasculaire cérébral (CVE), les cellules sont l'un des types de cellules qui composent la BBB; ces cellules ont une demande très haute énergie, ce qui nécessite la fonction mitochondriale optimale. Dans le cas d'une maladie ou d'une blessure, la fonction mitochondriale dans ces cellules peuvent être modifiées, entraînant la maladie ou l'ouverture de la BHE. Dans ce manuscrit, nous introduisons une méthode pour mesurer la fonction mitochondriale dans les cellules CVE en utilisant des cellules intactes, entières et un Bioanalyseur. Un essai mito-stress est utilisé pour contester les cellules qui ont été perturbés, physiquement ou chimiquement, et d'évaluer leur fonction bioénergétique. En outre, cette méthode fournit également un moyen utile pour dépister de nouveaux traitements qui ont des effets directs sur la fonction mitochondriale. Nous avons optimisé la densité cellulaire nécessaire pour obtenir des taux de consommation d'oxygène qui permettent le calcul d'une variété de para mitochondrialemètres, y compris la production d'ATP, la respiration maximale et la capacité de réserve. Nous montrons aussi la sensibilité de l'essai en démontrant que l'introduction du micro-ARN miR-34a, conduit à une diminution prononcée détectable et l'activité mitochondriale. Bien que les données présentées dans le présent document est optimisé pour la lignée cellulaire bEnd.3, nous avons également optimisé le protocole pour les cellules CVE primaires, ce qui suggère davantage l'utilité dans des modèles précliniques et cliniques.
Introduction
Il est largement reconnu que le sang-cerveau-barrière (BBB) formé par endothéliales vasculaire cérébral (CVE), les cellules a des fonctions très distinctes et uniques primordiaux à la biologie vasculaire. Ces cellules endotheliales utilisent mitochondries pour générer la majeure partie de l'approvisionnement cellulaire de l'adénosine triphosphate (ATP) comme source d'énergie chimique. En plus de fournir de l' ATP pour les cellules CVE, les mitochondries régulent divers processus cellulaires dans les cellules endothéliales vasculaires, telles que les cellules de signalisation 4/1, de l' apoptose 5, et le contrôle du cycle cellulaire et la croissance cellulaire 6. De dysrégulation de la fonction de bio - énergétique mitochondrial dans des cellules CVE peut affecter la biogenèse mitochondriale, ce qui conduit à l' activité de l' endothélium vasculaire avec facultés affaiblies, et exacerber les maladies cérébro - vasculaires et les maladies neurodégénératives, par exemple, accident vasculaire cérébral 7,8 et la maladie d'Alzheimer (AD) 9. Nous avons démontré que les propos injurieux à cellules CVE après une exposition à lipopolysaccharide (LPS) altère la fonction mitochondriale dans les cellules CVE et aggraver AVC résultats 7. Tert-butylhydroquinone (tBHQ) augmente la mortalité par AVC en interférant avec la phosphorylation oxydative dans les cellules CVE 10. Par conséquent, le modèle quantitatif de la fonction bioénergétique dans les cellules CVE non seulement les pilotes d'une série d'études relatives mécanisme-pour le système nerveux central (SNC), mais fournit également une percée dans le dépistage des drogues de thérapies ciblant la fonction mitochondriale en biologie vasculaire.
mitochondries isolées ont été utilisées pour mesurer la fonction bioénergétique. Nous 7 et d' autres 11 ont rapporté des évaluations de bioénergétique cellulaire dans les cellules intactes CVE en utilisant un Bioanalyseur flux extracellulaire. L'analyseur offre l'avantage de l'évaluation bioénergétique cellulaire endogène. Cet essai sensible et cohérente mesure le métabolisme mitochondrial des cellules EVF et peut être utilisé pour évaluer la dépréciation bioénergétique par stimuli, enquêter sur les mécanismes de voies de signalisation mitochondriales, et le dépistage des drogues ou des traitements qui affectent la fonction mitochondriale dans les cellules CVE. Le taux de consommation d'oxygène (OCR) est enregistrée par le Bioanalyseur en utilisant une approche de profilage pharmacologique en combinant l'utilisation de quatre dérégulateurs mitochondriales: oligomycine, carbonyl cyanide-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), roténone et antimycine A. Dans ce protocole, nous détaillons une approche optimisée qui permet la mesure et le calcul des paramètres fonctionnels mitochondriales dans les cellules de CVE, y compris la respiration basale mitochondrial, la production d'ATP, fuite de protons, la respiration maximale et la capacité respiratoire de secours, dans un seul essai.
Protocol
NOTE: Le régime du protocole est illustré à la figure 1, y compris un calendrier des procédures.
1. Culture et Passage des cellules CVE
- Culture des cellules CVE (cellules bEnd.3) en milieu de croissance complet (milieu de Eagle modifié de glucose élevé Dulbecco, DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine dans un T75 cm 2 flacon de culture tissulaire. Croissance à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
- Retirer et jeter le milieu de culture cellulaire. Rincer la couche cellulaire avec 0,25% de solution d'EDTA-trypsine à 0,03%, puis ajouter 1 - 2 ml de solution de trypsine-EDTA dans le ballon et maintenir le ballon à 37 ° C pendant 3 à 5 min. Observer les cellules sous un microscope inversé jusqu'à ce que la couche de cellules est détaché. Ajouter 10 ml de milieu de croissance complet et aspirer les cellules par pipetage.
- Décanter le liquide et les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger à 700 g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires. Jeter le surnageant du tube de centrifugation. Ajouter 10 ml de milieu de croissance complet et remettre en suspension le culot cellulaire. Faites tourner les cellules à 700 g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant du tube de centrifugation. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de croissance complet à une concentration de 2,0 x 10 5 cellules / ml (déterminée par comptage en utilisant un hémocytomètre, d' exclure les cellules mortes par une coloration au bleu trypan).
REMARQUE: les cellules fraîchement décongelés sont sous-cultivés pendant au moins 3 passages pour les expériences.
2. Seed et traiter les cellules sur des plaques de culture cellulaire
- cellules de semences sur un flux plaque extracellulaire 96 puits de culture cellulaire: 80 pl / puits. Placer la plaque de culture cellulaire à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Note: 16 × 10 3 cellules par puits atteindra 60-80% de confluence dans les 24 h.
- Si les cellules sont exposées à un produit chimique, ajouter les traitements une fois que les cellules sont fixées au fond de la plaque (8 - 24 h après voirding).
NOTE: Pour les expériences de transfection, ne pas ajouter d'antibiotiques dans le milieu de croissance complet.
3. Évaluation des mitochondrial Fonction Utilisation du Bioanalyseur
- Avant le début de l'essai, un hydrate d' une cartouche de capteur de flux extracellulaire calibrant par addition de 150 ul de solution extracellulaire du flux calibrant à la plaque et l' incubation O / N à 37 ° C sans CO 2.
- Utilisation de la station de lavage de plaques, de changer le milieu de culture cellulaire dans un pH de 7,0 extracellulaire flux de milieu d'essai. Incuber les cellules à 37 ° C sans CO2 pendant 30-60 min.
- Préparer des solutions de travail de 8 uM oligomycine, 4,5 uM FCCP, 10 uM roténone, et 10 uM antimycine A dans DMEM. Charge 25 uL des solutions mères dans les ports d'injection de cartouche: Port A, oligomycine; Port B, FCCP; Port C, roténone et antimycine A avec un milieu de dosage flux extracellulaire. Mettre en oeuvre le protocole d'essai décrit dans le tableau 1.
- Chargez la cartouche hydratée dans le Bioanalyseur et effectuer l'étalonnage en cliquant sur le bouton "Démarrer". Après la calibration est terminée, retirez la plaque de fond de la cartouche et charger la plaque de cellule en cliquant sur l'invite "Unload Cartridge". Poursuivre l'essai jusqu'à la fin de toutes les mesures.
- Ouvrez le fichier de données et obtenir les valeurs de taux de la Bioanalyseur. Exporter les données dans un fichier de feuille de calcul.
4. Analyses de données
NOTE: Les calculs pour les analyses de données sont formulées ci-dessous. Les valeurs sont obtenues à partir de l'instrument de bioanalyser comme OCR présenté dans la figure 2.
- Pour calculer la respiration basale, soustraire la respiration non-mitochondrial (mesures 10 - 12) à partir de la valeur basale (mesure 3).
REMARQUE: la respiration basale = Basal - respiration non-mitochondrial = Taux ③ - Taux ⑩ ~ ⑫. - Pour calculer producti ATPsur, soustraire la respiration ATP lié (mesures 4 - 6) de la valeur basale (mesure 3).
NOTE: la production d'ATP = Basal - respiration ATP lié = Taux ③ - Taux ④ ~ ⑥. - Pour calculer la respiration Maximal, soustraire la respiration non-mitochondrial (mesures 10 - 12) à partir de la respiration maximale (mesures 7 - 9).
REMARQUE: la respiration Maximal = respiration maximale - non-mitochondrial respiration = Taux ⑦ ~ ⑨ - Taux ⑩ ~ ⑫. - Pour calculer la capacité de rechange, soustraire la valeur basale (mesure 3) de la respiration maximale (mesures 7 - 9).
NOTE: La capacité de réserve = respiration maximale - Basal = Taux ⑦ ~ ⑨ - Taux ③. - Pour calculer Proton fuite, soustraire la respiration non-mitochondrial (mesure 10-12) de la respiration ATP liée (mesure 4).
NOTE: Proton fuite = respiration ATP lié - non-mitochondriesl respiration = Taux ④ - Taux ⑩ ~ ⑫.
Representative Results
Pour évaluer la fonction bioénergétique de cellules CVE en réponse au stress oxydatif, nous avons choisi le cerveau microvasculaire lignée cellulaire endothélium murin bEnd.3, qui affiche les mêmes caractéristiques de barrière comparatifs microvasculaires du cerveau primaire des cellules endothéliales 12. Étant donné que la cinétique et l'intensité relative de la réponse varient entre les différents types de cellules, la première série d'expériences a été conçue pour obtenir des niveaux mesurables de ROC en identifiant le nombre optimal de cellules bEnd.3 à utiliser dans le dosage pour le profilage métabolique, représenté sur la Figure 2. Suite à l'évaluation, les données sont quantifiés et présentés à la figure 3. respiration basale, la respiration maximale et la capacité respiratoire de secours a montré une réponse proportionnelle à la densité cellulaire. Cependant, la production d' ATP diminue lorsque 64 × 10 3 cellules par puits ont été sélectionnés, ce qui suggère que la culture sur-confluentes cellulaire estne convient pas pour cette expérience. Les densités cellulaires optimales se produisent entre 8-32 × 10 3 cellules par puits, en fonction de la réponse aux perturbateurs mitochondriales.
Pour les expériences ultérieures, une densité d'ensemencement de 16 × 10 3 cellules par puits a été utilisé pour permettre une détection optimale des changements dans l' OCR. Utilisation de 16 × 10 3 cellules par puits, nous avons observé les réponses attendues en OCR et démontré que le microARN miR-34a réduit la fonction mitochondriale dans les cellules de CVE (Figure 4). Nous avons précédemment rapporté que miR-34a a réduit la phosphorylation oxydative dans ces cellules 13. Les expériences répétées ont également montré que la respiration maximale et la capacité de réserve ont été diminué de façon significative par la surexpression de miR-34a dans CVEs à 24 h post-transfection, même si la respiration basale, la production d' ATP, et fuite de protons avait aucun changement significatif (Figure 4) . Ces donnéesdémontrer la sensibilité du Bioanalyseur pour détecter les changements dans la fonction mitochondriale dans CVEs.
Figure 1. Planification stratégique pour l'expérience. Le calendrier de la cellule, la plaque, et la préparation de la cartouche est indiquée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentant des données brutes de la fonction bioénergétique dans les cellules CVE avec différentes densités cellulaires. Les taux de consommation d'oxygène ont été mesurés dans les cellules CVE avec différentes densités cellulaires. Les données représentent la moyenne ± écart-type (n = 5); OCR: Oxygène Taux de consommation; FCCP: carbonyl cyanide-4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Rot / Anti-A: roténone et antimycine A. ①, ② et ③ indiquent la respiration basale; ④, ⑤, ⑥ et indiquer l'ATP lié respiration; ⑦, ⑧ et ⑨ indiquer la respiration maximale; ⑩, ⑪ et ⑫ indiquer la respiration non-mitochondrial. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les résultats représentatifs de la fonction bioénergétique dans les cellules CVE avec différentes densités cellulaires. Respiration basale, la production d' ATP, la respiration maximale et la capacité de secours sont calculées à partir des données brutes générées par la bioénergétique analyse fonctionnelle de la figure 2 en utilisant les formules indiquées dans la section 4 . Les données représentent moyenne ± écart type (n = 5); OCR: Oxygène Taux de consommation. f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Résultats représentatifs de la fonction bioénergétique Diminué par miR-34a (A) Les données brutes de mitochondrial Fonction suivante surexpression de miR-34a à 24 h post-transfection.. (B) de la respiration basale, la production d' ATP, la respiration maximale et la capacité de réserve sont calculées à partir des données brutes générées par les bioénergétique d'analyse fonctionnelle de la figure 4A; les paramètres sont calculés selon les formules indiquées dans la section 4. La surexpression de miR-34a réduit la fonction mitochondriale dans les cellules de CVE à 24 h post-transfection. Les données représentent la moyenne ± écart-type (n = 5); OCR: Oxygène Taux de consommation. **** P <0,0001.fichiers / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Le Protocole Run Instrument.
Discussion
Ce protocole représente un procédé d'évaluation du phénotype bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux. Il sert de test de base pour l'évaluation des mitochondries des cellules endothéliales, et il est optimal pour des expériences conçues pour étudier les mécanismes de stimuli qui peuvent influer sur la voie de signalisation mitochondriale dans les cellules CVE. Elle fournit également un procédé de test d'agents thérapeutiques potentiels pour des maladies BBB perturbations associées.
Étapes critiques dans le Protocole
bioanalyzers flux extracellulaires ont la capacité de mesurer OCR en temps réel. Dans cet essai, l'identification de la densité de cellules appropriée est critique. Si la densité cellulaire est inférieure à 8 × 10 3 cellules par puits, l'OCR basale est trop faible pour être analysés (Figure 2 et Figure 3); si la densité des cellules est supérieure à 32 x 10 3 cellules par puits, les cellules ne répondent pas à l' oligomycine ou FCCP Treatments (figure 2 et figure 3). La densité cellulaire optimale pour cette lignée cellulaire dans notre modèle expérimental est de 16 × 10 3 cellules par puits, ce qui démontre des résultats reproductibles et la sensibilité aux stimuli 7 et traitements 10,14. Si un Bioanalyseur 24 puits est utilisé, les nouveaux titrages de la densité cellulaire seraient nécessaires pour le dosage.
Il est établi que CVEs ont un grand volume de mitochondries par rapport aux autres cellules endothéliales ou des types de tissus 15,16, ce qui suggère la nécessité d' une plus grande production d'énergie et moins de cellules pour mesurer le métabolisme bioénergétique. Nous avons testé plusieurs types de cellules endotheliales du cerveau, telles que la première et immortalisé des cellules endothéliales vasculaires cérébraux de souris immortalisée 7 et les cellules endothéliales vasculaires cérébrales humaines (données non publiées). Ces cellules doivent densités cellulaires similaires pour atteindre l'OCR acceptable (respiration basale OCR dans les 40-160 pmol / min pourdes plaques à 96 puits et 50-400 pmol / min pour des plaques à 24 puits) lorsque le test a été effectué bioénergétique. Kaczara et al. Rapporté mesurer le métabolisme bioénergétique dans la veine des cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC), qui a utilisé une densité cellulaire plus élevée 17.
Notre groupe n'a pas évalué les cellules des vaisseaux provenant d'autres tissus ou d'organes. Théoriquement, le Bioanalyseur pourrait être utilisé sur tout type de cellule, mais il nécessite l'optimisation de l'essai pour la densité cellulaire, le milieu de culture cellulaire, et les conditions de culture (certaines cellules spécifiques peuvent nécessiter des plaques revêtues pour bien grandir). Il est nécessaire que les expériences sont effectuées pour s'assurer que le taux d'OCR se situe dans la plage acceptable. Si l'OCR dans les cellules endothéliales des autres organes est inférieur à CVEs de cerveaux, l'augmentation de la densité cellulaire peut aider à obtenir dans une plage OCR acceptable. Par ailleurs, si les cellules ne sont pas utilisent la phosphorylation oxydative comme leur principale source d'énergie, l'Bioanalyseur ne serait pas un optimal essai.
Bioanalyseur permet l'interruption séquentielle de la chaîne de transport d'électrons, en fonction de l'ordre dans lequel les réactifs sont appliqués. Tout d'abord, oligomycine est appliqué, ce qui inhibe mitochondrial complexe V (ATP synthase). En second lieu, FCCP, un découpleur d'électrons, est appliqué, ce qui conduit à la rupture du gradient de proton. Enfin, la roténone et antimycine A, qui inhibent mitochondrial Complexes I et III, respectivement, sont appliquées à conduire à une inhibition totale du flux d'électrons. L'ordre de l'exposition au médicament est essentiel parce que les médicaments bloquent la réaction spécifique de la chaîne de transport d'électrons, et les changements séquentiels peut être mesurée afin de refléter la fonction mitochondriale.
Modifications et dépannage
Afin d'évaluer la réponse à des stimuli mitochondriale dans les cellules CVE, il est recommandé que les stimuli sont appliqués à des cellules après que les cellules adhèrent au fond de la plaque de culture cellulaire (voir la chronologiereprésenté sur la figure 1; il faut habituellement au moins 6 h). Pour obtenir des résultats reproductibles par des traitements, il est extrêmement important de maintenir la densité cellulaire compatible. Si prétraitements sont conçus avant l'ensemencement des cellules, la densité cellulaire pour chaque pré-traitement doit être soigneusement mesuré, à l'exclusion des cellules mortes pour l'ensemencement. Si transfection est inclus dans le plan expérimental, reportez-vous au protocole de transfection du fabricant. Démontrée dans les données présentées dans la figure 4, miR-34a a été transfecté dans les cellules CVE en utilisant un kit lipofectamine de transfection, ce qui nécessite un milieu de culture cellulaire exempt d'antibiotiques et un test mito-stress pour évaluer les changements dans la fonction métabolique avec surexpression de miR-34a . Les doses de plasmide peuvent également être optimisés, comme précédemment publiée 13. Un autre changement qui peut être fait pour le protocole est en train de changer les concentrations des réactifs. Une courbe de titrage de l'oligomycine, FCCP, et / ou la roténone et antimycine A peut être completed.
En outre, si ce test est utilisé pour un débit élevé des analyses de divers médicaments, il est suggéré d'inclure un essai parallèle pour mesurer la viabilité cellulaire et la prolifération cellulaire, qui a été décrit dans nos publications antérieures 7,13. Les valeurs OCR sont affectés de façon significative par le nombre de cellules (figures 2 et 3), ainsi que les essais de prolifération cellulaire et de viabilité profitent à la normalisation des données. Cependant, la réalisation de ces essais sont à la discrétion de chaque laboratoire.
Limites de la technique
La principale limite de ce protocole est que nous avons seulement utilisé un modèle in vitro de culture cellulaire dans l'étude. À l' heure actuelle, il n'y a pas d' anciens modèles disponibles in vivo ou des modèles animaux qui peuvent répondre à des cellules endothéliales de la fonction mitochondriale. De nouveaux modèles devraient être mis au point pour l'évaluation de la fonction bioénergétique in vivo et Une autre limitation est l'extension des évaluations de la barrière à la suite des mesures bioénergétiques. Les expériences ne peuvent être exécutées parce que, d'abord, après l'achèvement des mesures bioénergétiques, la viabilité cellulaire est diminuée après la rupture complète de la chaîne de transport d'électrons; deuxièmement, des plaques et des inserts de culture cellulaire spécifiques sont nécessaires pour détecter les valeurs bioénergétiques et ne correspondent pas à des inserts pour les évaluations de barrière. Par conséquent, il n'y a pas beaucoup de tests fonctionnels qui peuvent être complétés après le test bioénergétique. Cependant, il est prévu que des dispositifs spéciaux peuvent être développés pour effectuer des tests fonctionnels avant le dosage bioénergétique. Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives Les techniques antérieures pour évaluer la fonction mitochondriale ont nécessité l'isolement des mitochondries des cellules 18. Ce netechnique w utilisant le Bioanalyseur permet de mesurer l'activité mitochondriale dans des cellules intactes, qui conserve plus de l'environnement cellulaire que d'évaluer les mitochondries isolées. Applications futures ou les directions après la maîtrise de cette technique Ce protocole a été conçu et développé pour la lignée cellulaire bEnd.3, mais il est également compatible avec endothéliales vasculaires cérébrales primaires (PCVE) 7 cellules ou autres endothélium, et nous avons démontré dans notre publication précédente en utilisant des cellules PCVE 7. Lorsque d'autres types d'endothélium sont utilisés, le revêtement de la plaque de culture et l'utilisation de facteurs de croissance peuvent être nécessaires. Toutefois, l'analyse de titrage est recommandée pour les autres types cellulaires aussi bien. Ce protocole offre une méthode générale à adopter dans l'évaluation de la bioénergétique de cellules CVE, et il peut en outre être appliquée à des études de mécanisme ou de réponses thérapeutiques de cette manière.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25 - 30 passages |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% final concentration |
| Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
| 0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM final concentration |
| Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM final concentration |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM final concentration |
| Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM final concentration |
| Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM final concentration |
| Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM final concentration |
| Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
| Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
| Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |
References
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